Філаріальна інфекція або введення антигену покращують толерантність до глюкози у мишей із ожирінням, індукованих дієтою
Доктор Марк П. Хюбнер
Інститут медичної мікробіології, імунології та паразитології
Університетська лікарня Бонна, корпус 63
Sigmund-Freud-Strasse 25, DE-53105 Бонн (Німеччина)
Статті, пов’язані з "
- Електронна пошта
Анотація
Вступ
Недавні перехресні дослідження в Індії, Індонезії, сільських районах Китаю та аборигенів в Австралії показали, що поширеність гельмінтозів серед хворих на СД2 значно нижча, ніж у недіабетичних контрольних групах, незалежно від соціально-економічних відмінностей у доходах та харчуванні, припускаючи, що гельмінтозні інфекції можуть дійсно запобігати або затримувати настання T2D [15,16,17,18]. Можливі опосередковані гельмінтами захисні механізми включають зниження регуляції прозапальних імунних реакцій, пов'язаних з T2D, індукцію імунних реакцій типу 2, стимулювання засвоєння жирних кислот або посилення експресії генів, пов'язаних з чутливістю до інсуліну. Це підтверджується висновком про те, що введення антагоніста рекомбінантного рецептора (анакінри) блокує передачу сигналів про запальний цитокін IL-1β, що покращує глікемію та секрецію інсуліну з β-острівцевих клітин хворих на Т2D [19]. Подібним чином терапія анти-TNFα покращувала засвоєння глюкози у мишачої моделі T2D [20]. Сприятливий вплив покращеного засвоєння жирних кислот на поліпшення чутливості до інсуліну було також показано в ряді досліджень [21,22].
У цьому дослідженні ми досліджували, чи L.s. інфекція або L.s. Введення екстракту глиста для дорослих (LsAg) покращує толерантність до глюкози у мишей DIO та аналізує можливі захисні механізми.
Матеріали і методи
Заява про етику
Умови утримання тварин та процедури, використані у цій роботі, виконувались відповідно до керівних принципів Європейського Союзу щодо добробуту тварин. Всі протоколи були затверджені Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Кельн, Німеччина (87-51.04.2010.A355 та 84-02.04.20144.A131).
Тварини та догляд за тваринами
Експерименти проводились із використанням самців мишей дикого типу (WT) та ΔdblGATA на фоні BALB/c, а також мишей C57BL/6J WT та C57BL/6 DEREG. Мишей BALB/c та C57BL/6J було придбано у лабораторії Janvier (Le Genest-St.-Isle, Франція). Миші ΔdblGATA спочатку отримували з лабораторії Джексона (Бар-Харбор, штат Мен, США), а мишей DEREG C57BL/6 забезпечували проф. Д-р Тім Спарвассер та д-р Катаріна Лал (Центр експериментальних та клінічних інфекцій TWINCORE, Ганновер, Німеччина). Мишей розводили і розміщували в приміщеннях для тварин університетської лікарні Бонна. Мишей утримували в індивідуально провітрюваних клітинах з 12-годинним денно-нічним циклом та їжею та водою за бажанням. Починаючи з 6-8 тижневого віку, підгрупи мишей годували високожирною дієтою (ВВ), яка забезпечує 60% калорій з жиру (Research Diets, Inc., Brogaarden, Данія).
Л.с. Інфекція
L.s. зараження здійснювалось природним зараженням, як описано раніше [23]. Якщо не зазначено інше, сприйнятливі миші BALB/c заражались у віці 8-10 тижнів, через 1-2 тижні після початку ВЧ-дієти. Для природного зараження личинки інфекційного L3 передавались із кров’яним шротом інфікованих Ornithonyssus bacoti кліщі. Личинки L3 мігрують у грудну порожнину, де линяються у дорослих глистів (~ 30 днів після зараження). На момент вскрыття статус зараженості мишей підтверджували скринінгом на наявність дорослих глистів у грудній порожнині.
Підготовка та адміністрування LsAg
LsAg готували, як описано раніше [24]. Коротко, L.s. дорослих черв'яків збирали з грудної порожнини заражених бавовняних щурів або піщанок та механічно гомогенізували на льоду в PBS без ендотоксинів (PAA, Пашинг, Австрія) за допомогою стерильного скляного гончара. Після центрифугування при 3200 g, супернатант збирали і вимірювали концентрацію білка за допомогою аналізу Бредфорда (Cytoskeleton, Denver, Colorado, USA). Аликвоти LsAg зберігали для подальшого використання при -80 ° C.
Щоденні внутрішньочеревні ін'єкції 2 мкг LsAg на мишу протягом 2 тижнів робили самцям мишей C57BL/6J DIO протягом 8-10 або 12-14 тижнів ВЧ-дієти. Контроль отримував однакову кількість стерильного PBS (PAA). Після остаточної ін’єкції LsAg всі групи мишей проходили тест на толерантність до глюкози (GTT), а імунологічні дослідження проводили через 1 тиждень після цього. У подальшому експерименті з використанням мишей DEREG C57BL/6 (виснаження в регуляторних Т-клітинах) мишей [25,26], групи мишей поміщали на ВЧ дієту протягом 14 тижнів. Між 8 та 10 та 12 та 14 тижнями групи отримували або щоденні внутрішньочеревні ін’єкції LsAg (2 мкг/миша) або PBS. Після остаточного введення LsAg мишей контролювали на толерантність до глюкози.
GTT та тест на толерантність до інсуліну
Через 6 год голодування мишам вводили внутрішньовенно. з 2 г розчину глюкози на кілограм маси тіла. Рівні глюкози в крові вимірювали з крові хвостових вен за допомогою глюкометра (Accu-Check Advantage; Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Німеччина) безпосередньо перед та через 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін’єкції глюкози. Площа під кривою (AUC) була отримана шляхом обчислення площі між віссю х та даною кривою за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 5.03; GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Як зазначалося вище, в окремому експерименті з використанням мишей DEREG C57BL/6 Foxp3 + Т-клітини виснажувались двома послідовними інтраперитонеальними ін'єкціями 1 мкг дифтерійного токсину (Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина) за 3 та 2 дні до GTT (з використанням 1,5 г глюкози/кг маси тіла).
Для тесту на толерантність до інсуліну їжу видаляли безпосередньо перед ін’єкцією інсуліну. Інсулін (1 од/кг маси тіла) вводили внутрішньочеревно, а рівні глюкози в крові брали безпосередньо перед і через 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін’єкції інсуліну.
Виділення строкової судинної фракції жирової тканини
Виділення фракції судин строми (SVF) із жирової тканини проводили, як описано раніше [3]. Коротше кажучи, епідидимальні жирові прокладки від самців мишей, яких годували звичайною чау-їжею або високочастотною дієтою, вирізали та подрібнювали в середовищі DMEM/низькому вмісті глюкози, що містить 1 г/л D -глюкози, 4 м ML-глютаміну (PAA), 25 м M HEPES ( Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США), 1% BSA (PAA) та 1% пеніцилін-стрептоміцину (PAA). Потім подрібнену тканину обробляли середовищем, що містить 1,5 мг/мл колагенази-P (Roche), протягом 20 хв при 37 ° C. Після центрифугування плаваючі адипоцити відкидали з супернатантом, а гранулу SVF ресуспендували в 1 × буфері лізису еритроцитів (eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Після етапу промивання клітини блокували для аналізу FACS шляхом інкубації з анти-CD16/анти-CD32 (BD Biosciences, Гейдельберг, Німеччина) в 1 × Ca 2+ - і без Mg 2+ - фосфатно-сольовому розчині Дюльбекко, включаючи 2 м M EDTA і 1% FCS (PAA) при кінцевій концентрації 0,5-1 мкг/10 6 клітин протягом 1 год. Суспензію клітин фільтрували через 100-мкм фільтр.