Фітохімічний індол-3-карбінол, що дієтичний, є природним ферментативним інгібітором еластази, який порушує

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Відредаговано Джоном Е. Халвером, Університет Вашингтона, Сіетл, Вашингтон, та затверджено 20 жовтня 2008 р. (Надійшло на огляд 18 липня 2008 р.)

Анотація

Еукаріотичний клітинний ріст залежить від активації білкових комплексів циклін/циклінозалежна кіназа (CDK), які функціонують на певних стадіях клітинного циклу (23). У багатьох пухлинах молочної залози спостерігається підвищений рівень цикліну Е та цикліну D, що означає втрату контролю клітинного циклу шляхом дерегуляції фази G1 клітинного циклу (24, 25). У клітинах ссавців виявлені як високомолекулярні, так і нижчомолекулярні форми цикліну Е. Цікаво, що багато високопроліферативні тканини, такі як метастатичний рак молочної залози, переважно експресують нижчомолекулярні форми цикліну Е (26-28), тоді як відповідні нормальні тканини зазвичай мають більш високомолекулярну форму цикліну Е ( 26).

Раніше ми повідомляли, що лікування I3C клітин раку молочної залози людини MCF-7 спричинило утворення неактивного білкового комплексу CDK2 на 200 кДа порівняно з активним комплексом білка CDK2 на 90 кДа, що спостерігається у необроблених зростаючих клітинах (29). За відсутності I3C, форми цикліну Е 35-/33-кДа з нижчою молекулярною масою асоціюються з CDK2, що, як було показано, надає гіперактивності білковому комплексу CDK2 та збільшує проліферацію клітин (27). На відміну від цього, після обробки I3C переважною формою цикліну Е є високомолекулярний вид 50 кДа, який продукує неактивний білковий комплекс CDK2 (29). Таким чином, лікування I3C відновлює контроль фази G1 клітинного циклу в клітинах раку молочної залози людини шляхом сприяння накопиченню цикліну Е 50 кДа замість форм цикліну Е з нижчою молекулярною масою.

Результати

I3C безпосередньо пригнічує активність людської еластази та переробку білка цикліну Е.

За допомогою аналізу обробки цикліну Е in vitro інгібуючі ефекти I3C на активність нейтрофільної еластази людини порівнювали з добре охарактеризованими інгібіторами еластази, еластатином (Elast) та метоксисукциніл-Ала-Ала-Про-Вал-хлорметилкетоном (CMK) (37, 38 ). Як показано на рис. 1C, I3C був настільки ж ефективним, як еластатинальний, або CMK, у запобіганні еластазозалежній обробці 50-кДа цикліну Е. За відсутності будь-яких інгібіторів еластази нижчомолекулярні форми цикліну Е можуть бути виявлено в залежності від еластази (Cyc E DNA проти DMSO еластазних смуг).

Індольна специфічність пригнічення еластази.

Індольна специфічність I3C пригнічення ферментативної активності еластази. (A) Аналіз проточної цитометрії клітин MDA-MB-231, оброблених протягом 72 годин контролем DMSO, 100 мкМ I3C, 30 мкМ DIM або 100 мкМ триптофолу. (B) Клітини MDA-MB-231 обробляли 100 мкМ I3C, 30 мкМ DIM, 100 мкМ триптофолу або DMSO-контролем протягом 72 годин. Половину імунопреципітованого цикліну Е оцінювали на пов'язану активність кінази CDK2, використовуючи Histone H1 як субстрат in vitro, а іншу половину аналізували на форму цикліну Е за допомогою вестерн-блот. (В) Вплив індолів на переробку нейтрофільної еластази людини цикліном Е аналізували за допомогою системи транскрипції-трансляції in vitro, як описано. Зазначені реакційні суміші містили DMSO-контроль, 50 мкМ I3C, 30 мкМ DIM або 50 мкМ триптофолу.

Аналіз обробки білка циклін Е in vitro з використанням очищеної еластази використовувався для вибіркової оцінки індолу інгібування еластази. Як показано на рис. 2C, I3C інгібував еластазу-опосередковану обробку цикліну Е in vitro, оскільки рівень решти цикліну Е 50 кДа був подібним до рівня, виявленого за відсутності будь-якої доданої еластази (смуга ДНК Cyc E). На відміну від цього, у присутності DIM або триптофолу опосередкована еластазою обробка цикліну Е 50 кДа була подібна до реакцій обробки in vitro, що контролює носій, що демонструє, що активність еластази не гальмується жодною молекулою. Зимографія очищеної еластази підтвердила ці результати, оскільки I3C, але не DIM або триптофол, безпосередньо пригнічували активність еластази (дані не наведені).

I3C діє як неконкурентний інгібітор ферментативної активності еластази людини.

Кінетичний аналіз індольного інгібування активності еластази. (A) Аналіз обробки in vitro еластази цикліну Е був використаний для визначення ефекту I3C на Km та Vmax для ферментативної активності нейтрофільної еластази людини. Еластазу людини, зазначені концентрації субстрату цикліну Е та вказану концентрацію I3C змішували до загального обсягу 20 мкл і інкубували протягом 5 хв при 37 ° C з подальшим аналізом вестерн-блот-циклу Е. Швидкості реакцій визначали як функція втрати 50-кДа білка циклін Е і були графічно порівняні з концентрацією цикліну Е. (B) Аналіз ділянки Lineweaver – Burk та Dixon щодо інгібування I3C інгібування еластазної обробки цикліну Е з використанням реакцій транскрипції-трансляції in vitro. Подвійне взаємне графічне співвідношення 1/швидкість проти 1/підкладки дає ділянку Lineweaver – Burk. Для графіків Діксона співвідношення 1/V побудовано на основі різних концентрацій I3C при 2 різних концентраціях субстрату (0,6 та 1,2 нг), а значення Ki графічно визначали як перетин з абсцисою. (C) Lineweaver – Burk and Dixon сюжетний аналіз I3C пригнічення гідролізу еластази людини хромогенного субстрату метоксисукциніл-Ала-Ала-Про-Валь-р-нітроанілід (MetS).