Гіперхолестеринемія з збагаченим холестерином ЛПНЩ та нормальними рівнями ЛПНЩ – аполіпопротеїн В

Від Центру харчування людей та відділів клінічного харчування, внутрішньої медицини та біохімії Південно-західного медичного центру Техаського університету в Далласі та Медичного центру у справах ветеранів, Даллас, штат Техас.

Анотація

Гіперхолестеринемія є багатофакторною за своїм походженням. 1 2 Для більшості форм гіперхолестеринемії характерні підвищені концентрації холестерину ЛПНЩ у плазмі крові, а в більшості випадків також підвищуються рівні ЛПНЩ-аполіпопротеїну В-100 (апо В). 1 Кілька механізмів можуть призвести до високого рівня LDL-апо B; вони включають знижену активність рецепторів ЛПНЩ, 3 дефектних апо В, які перешкоджають нормальному зв’язуванню ЛПНЩ з рецепторами ЛПНЩ, 4 5 6 7 і, можливо, перевиробництво печінкою ліпопротеїнів, що містять апо В. 1 Крім того, нещодавно ми описали іншу форму підвищеного холестерину ЛПНЩ, при якій рівні ЛПНЩ-апо В не підвищуються. 1 Ця форма гіперхолестеринемії характеризується високим співвідношенням холестерину до апо B у частинках ЛПНЩ. Результатом цього підвищеного співвідношення є високий рівень холестерину ЛПНЩ в гіперхолестеринемічному діапазоні, а рівень ЛПНЩ-апо В в нормі. Дефект, мабуть, є зміною метаболізму холестерину, а не метаболізму апо В. Наші дані свідчать, що приблизно одна третина чоловіків з первинною середньою гіперхолестеринемією має такий стан1, і це може бути ще більш поширеною формою гіперхолестеринемії у жінок. 8

Одним із підходів до лікування цієї форми гіперхолестеринемії може бути зменшення співвідношення холестерин/апо В ЛПНЩ, а не зниження рівня ЛПНЩ-апо В. Цей підхід був би спрямований на основний дефект. Повідомлялося, що дві форми терапії - дієти з низьким вмістом жиру 9 та секвестранти жовчних кислот 10 11 - зменшують співвідношення холестерин/апо В ЛПНЩ, і, отже, вони можуть бути найкращою терапією для цього типу гіперхолестеринемії. З цієї причини ми виявили гіперхолестеринемічних пацієнтів чоловічої статі з відносно нормальним рівнем LDL – apo B, але підвищеним співвідношенням LDL холестерин/apo B, і ми досліджували їх реакцію послідовно на дієту зі зниженим вмістом жиру та секвестрант жовчних кислот. Питання, яке розглядалося, полягало в тому, чи ці форми управління дозволять змінити цей конкретний тип гіперхолестеринемії, що виникає внаслідок дефекту складу ЛПНЩ.

Методи

Пацієнти

Експериментальний дизайн

Процедури

Двадцять мілілітрів крові збирали щоразу після 12-годинного голодування. Кров забирали через пробір вени в пробірки, що містять динатрієву ЕДТА в концентрації 1 мг/мл. Плазму відокремлювали незабаром після забору крові при 4 ° C і зберігали при тій же температурі для аналізу. До зразків плазми додавали консерванти наступним чином: гентаміцину сульфат (0,005%), левоміцетин (0,005%), азид натрію (0,01%) і трасилол (100 МО/мл). Рівні загального холестерину та тригліцеридів у плазмі крові вимірювали ферментативно, 13 14 та холестерин ЛПВЩ вимірювали після осадження апо В-вмісних ліпопротеїдів із застосуванням 0,55 ммоль/л фосфовольфрамової кислоти та 25 ммоль/л хлориду магнію. 15 Холестерин в ЛПНЩ + IDL (d Виділення 16 ЛПНЩ + IDL проводили ультрацентрифугуванням протягом 18 годин при 39000 об/хв. Верхні 2 мл збирали кількісно; загальний холестерин вимірювали у фракціях щільності, менших і більших за 1,019 г/мл. Відновлення холестерину становило> 96%. ЛПНЩ + холестерин IDL (d 16 17 Коротко, ЛПНЩ (d= 1,019-1,063 г/мл) виділено з плазмового інфрантанату щільністю 1,019 г/мл. Загальний холестерин вимірювали ферментативно, а аполіпопротеїн - хімічно. 16 17 Розраховували співвідношення холестерину ЛПНЩ/апо В. Абсолютні концентрації апо B в LDL розраховували як добуток співвідношення холестерин/апо B в ізольованому LDL та абсолютної концентрації холестерину LDL. Рівні апо B в ЛПНЩ + IDL вимірювали осадженням апо B з використанням кінцевої концентрації 50% ізопропілового спирту, деліпідацією осаду 100% спиртом та повторним розчиненням апо B 1,5 моль/л дезоксихолевої кислоти натрію та 0,1 N NaOH. 16 18 Вміст білка вимірювали хімічно, використовуючи модифікацію Марквелла та співавт. 19 процедури Лоурі та співавт. 20 Загальний апо B розраховували як суму ЛПНЩ + IDL – апо B та LDL – апо B.

Коефіцієнти варіації для ферментативного методу кількісного визначення холестерину та хімічного методу кількісного визначення апо B становили ≤3,0%. Останній метод був стандартизований в нашій лабораторії наступним чином. По-перше, стандартом модифікації Марквелла 19 процедури Лоурі-Фоліну 20 є бичачий сироватковий альбумін, отриманий з Національного інституту стандартів і технологій. 17 По-друге, для безпосереднього вимірювання апо B в ЛПНЩ та ЛПНЩ + IDL, коефіцієнт хромогенності 1 застосовувався з причин, детально описаних раніше 17; по-третє, рівні апо B, виміряні хімічним методом та імунохімічними методами апо B, дають подібні значення з високим коефіцієнтом кореляції. 17

Поточне дослідження вимагало ізоляції ЛПНЩ (d= 1,019-1,063 г/мл) для визначення співвідношення холестерину ЛПНЩ до апо В у ліпопротеїнах цих пацієнтів. Також необхідно було визначити фізіологічні коефіцієнти варіації цих співвідношень у відібраних для дослідження пацієнтів. Ці коефіцієнти визначали протягом 5 днів протягом кожної з трьох фаз дослідження.

Пацієнтів тестували на наявність сімейного дефектного апо B-100 (мутація FDB-3500) шляхом ампліфікації генів та розщеплення з Msp I. 21 Коротко кажучи, геномну ДНК виділяли з цільної крові шляхом фенол-хлороформної екстракції та осадження етанолом. Під час ланцюгової реакції полімерази використовували два праймери. Праймер 1 був 5 ′ CCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCACCC 3 ′, а праймер 2 - 5 ′ CTGTGCTCCCAGAGGGAATATATGCGTTGG 3 ′. Ці праймери були отримані з кардіологічного відділу Південно-західного медичного центру Техаського університету в Далласі. Продукти травлення електрофорезували на неденатурирующем гелі з 12% акриламіду. Для оцінки розміру продуктів травлення використовували два маркери ДНК - Lambda C1 857-Dral та Msp/ puc 18. Смуги візуалізували під ультрафіолетовим світлом після обробки гелів бромідом етидію. У всіх пацієнтів спостерігалася одна смуга 120 п.н. Очікується, що у суб’єктів, гетерозиготних для глутаміну для мутації аргініну, будуть дві смуги 149 і 120 bp відповідно, тоді як гомозиготний випадок матиме лише одну смугу 149 bp. 21

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± SD. Порівняння засобів проводили шляхом повторних вимірювань ANOVA з корекцією Бонферроні для множинності обробок. Значення α 0,05/3 (0,0167) вважали статистично значущим. Коефіцієнти фізіологічних коливань визначали для співвідношень холестерину ЛПНЩ/апо B, і ці коефіцієнти також порівнювали повторними вимірами ANOVA.