Гістонова деацетилаза є ціллю дослідження вальпроєвої кислоти, опосередкованої клітинною диференціацією раку

Цифри та дані статті

Цифри

Будови вальпроєвої кислоти та аналоги. VPA, вальпроєва кислота; 2M2PP, 2-метил-2n-пропілпентанова кислота; 4PA, 4-пентенова кислота; 2M2P, 2-метилпентенова кислота; 2EH, 2-етилгексанова кислота; VPM, вальпромід.

деацетилаза

Інгібування гістонових деацетилаз (HDAC) з класів I та II in vitro за допомогою вальпроєвої кислоти (VPA) та аналогів. A, HDAC 1, 6 та 7, мічені епітопом, експресували в клітинах 293T, імунопреципітували та аналізували активність HDAC in vitro у присутності 0,3–20 м м VPA. Активність HDAC представлена ​​як відсоток від загальної активності кожного HDAC. Кожна показана точка даних представляє середню активність HDAC щонайменше з трьох незалежних експериментів. B, мічений Myc HDAC1 експресували в клітинах 293T, імунопреципітували та аналізували з кожним з аналогів VPA (0,1–20 м м); були побудовані засоби щонайменше трьох експериментів.

Інгібування деацетилаз гістону вальпроєвою кислотою (VPA) та аналогами VPA у культивованих клітинах. Клітини A, U937 обробляли 0,1–2 м м VPA протягом 18 год, щоб показати реакцію на дозу для ацетилювання гістону (ліва панель). Клітини K562 (права панель) обробляли 1 м м VPA і збирали в зазначені моменти часу для оцінки часового курсу для гіперацетилювання гістонів за допомогою VPA. У кожному випадку гістони виділяли та іммуноблотували на ацетильований гістон Н3 або фарбували кумасі синім, щоб показати загальну кількість гістонів у кожному зразку. Клітини B, K562 обробляли аналогами VPA 2 м м протягом 24 год; гістони виділяли та іммуноблотували на ацетильований гістон Н4 та загальний гістон Н4. C, клітини 293T трансфікували репортером SV40-люциферази, а наступного дня клітини розщеплювали на 6-лункові планшети та обробляли аналогами VPA 0,5–2 м м протягом 24 годин. Активність люциферази вимірювали в клітинних лізатах і наносили на графік як відносні одиниці люциферази. Клітини D, K562 обробляли 1 м м VPA та аналогами протягом 24 годин. Клітинні лізати імуноблотували для p21, гельсоліну та hnRNP-K (контроль завантаження).

Гістони, пов’язані з промотором ацетилювання p21, та індукція мРНК p21 після обробки вальпроєвою кислотою та аналогами. Клітини K562 обробляли вальпроєвою кислотою та аналогами протягом 24 годин та оцінювали на ацетилювання гістону Н4, асоційованого з промотором р21, за допомогою аналізу імунопреципітації хроматину (кількісно за допомогою ПЛР у реальному часі) або рівня мРНК за допомогою зворотної транскрипції-ПЛР у реальному часі. Збільшення кратності ацетилювання асоційованого з промотором p21 гістону H4 було побудовано на осі X, а індукція складки рівня р21 мРНК - уздовж осі Y. Дані представлені як засоби триразових аналізів у кожному випадку. Експерименти повторювали або три (імунопреципітація хроматину), або два (зворотна транскрипція-ПЛР) із подібними результатами.

Вальпроєва кислота (VPA) індукує диференціювання в клітинах U937. Клітини U937 обробляли VPA протягом 6 днів і аналізували на експресію CD11a, CD11b, CD11c, CD18 та CD64 поверхневі маркери за допомогою FCM. Гістограми показані для клітин, оброблених 0 (суцільними лініями), 0,5 (пунктирними лініями) та 1 м м VPA (пунктирними лініями), і представляють принаймні три незалежних експерименти для кожного маркера.

Індукція диференціювання в клітинах U937 за допомогою вальпроєвої кислоти (VPA) та аналогів VPA. Клітини A, U937 обробляли 2 м м аналогами VPA або VPA та аналізували на експресію CD11b методом FCM. Було побудовано відсоток CD11b-позитивних клітин (як середнє значення триразових зразків) ± SD. Клітини B, U937 обробляли VPA та аналогами та оцінювали на індукцію CD13 за допомогою FCM. Були побудовані середні інтенсивності для зазначених концентрацій VPA та аналогів. Клітини C, U937 обробляли VPA та аналогами та оцінювали на експресію HLA-DR за допомогою FCM. Були побудовані середні інтенсивності для зазначених концентрацій VPA та аналогів.

p21 необхідний для індукції диференціювання вальпроєвою кислотою (VPA) в клітинах U937. Стабільні клітинні лінії U937, що експресують або антисмисловий p21 (p21AS), або контроль порожнього вектора (CON; посилання 24) обробляли 0,25–2 м м VPA протягом 24 годин та імуноблотували для p21 або hnRNP-K (контроль навантаження). Дозозалежна індукція p21 виявляється в контрольних клітинах, але не в антисмислових клітинах p21. В, контрольні та р21 антисмислові клітини обробляли 0,1–1 м м VPA протягом 6 днів та аналізували на експресію CD11b методом FCM. CD11b індукувався в контрольних клітинах, але не в антисмислових клітинах p21. Була побудована графічна індукція середньої інтенсивності CD11b ± SD. Результати є репрезентативними для трьох експериментів. C, контроль та клітини U937, оброблені VPA 0,5 м м, аналізували на експресію CD11b у дні 1–5 та 7. Експресія CD11b зростала в контролі, але не р21 антисмислових клітин, оброблених VPA. Дані представлені у вигляді кратної індукції середньої інтенсивності CD11b після обробки VPA; кожна точка даних є середнім значенням три повторності ± SD.