Характеристика генетичної втрати функції Fus у даніо

Світлана Лебедєва

Інститут молекулярної біології, Майнц, Німеччина

Антоніо М. де Ісус Домінгуес

Інститут молекулярної біології, Майнц, Німеччина

Фальк Баттер

Інститут молекулярної біології, Майнц, Німеччина

Рене Ф. Кеттінг

Інститут молекулярної біології, Майнц, Німеччина

Пов’язані дані

АНОТАЦІЯ

РНК-зв’язуючий білок FUS бере участь у транскрипції, альтернативному сплайсингу нейрональних генів та репарації ДНК. Мутації в FUS пов'язані з нейродегенеративними захворюваннями людини, такими як ALS (бічний аміотрофічний склероз). Ми генетично порушили фуз у даніо (Danio rerio) за допомогою системи CRISPR-Cas9. Тварини, що нокаутують фуз, плодючі та не виявляли жодного характерного фенотипу. Мутація грибка викликає незначні зміни в експресії генів на рівні транскриптома та протеома в мозку дорослого. Ми спостерігали значний вплив генетичного фону на експресію генів та використання 3'UTR, що може замаскувати наслідки втрати Fus. На відміну від опублікованих fus morphants, материнські зиготичні fus-мутанти не виявляють мотонейрональної дегенерації та демонструють нормальну рухову активність.

Скорочення

Вступ

Результати

Алелі нокауту Fus у даніо

Ми використовували технологію CRISPR-Cas9 24, щоб зруйнувати ген fus данио-риби за допомогою однієї направляючої РНК, націленої на екзон 3 (рис. 1А). Всі наступні аналізи проводили на алелі, який видаляє 8 пар основ, в результаті чого відбувається зсув кадру та передчасний стоп-кодон (алель Δ8) (рис. 1А, Б). ІР-мРНК 88 все ще була у тварин, що нокаутували, хоча вона була приблизно в 2 рази менше в порівнянні з масовою мРНК (рис. 1С). Опубліковані антитіла, які використовувались для виявлення білка Fus даніо на Western blot 21, не змогли виявити Fus в ембріонах дикого типу в наших руках (не показано). Тому ми використовували мас-спектрометрію (МС) для того, щоб визначити, чи мРНК us8 злиття все ще здатна продукувати білок. Щоб мінімізувати можливий внесок материнського депонованого білка, ми проаналізували 5-денні ембріони з гетерозиготних поперек. Жодного пептиду, унікального для білка Fus, не було виявлено в жодній з 4 копій ембріонів fus -/-, тоді як 2 унікальних пептиду Fus були присутні у ¾ репліках братів і сестер дикого типу (табл. 1). Цей аналіз привів нас до висновку, що білок Fus не вироблявся, а алель fus Δ8 є мутацією втрати функції.

Генерування та перевірка дановидних риб, що нокаутують fus. (A) алелі фуза, генеровані CRISPR-Cas9. Знімок екрана з браузера геному UCSC показує вирівняні послідовності з гетерозиготних тварин F1. Цільовий сайт CRISPR у fus exon 3 підкреслено червоним кольором. (B) Приклад гелю PAGE для генотипування алелю Δ8. М = маркер низької молекулярної маси. Продукти дикого типу (75bp) та fus -/- (67bp) можуть бути дискриміновані. (C) Кількісне визначення мРНК fus щодо мРНК WT в ембріонах 5dpf. (D) Нормальна морфологія WT та fus -/- ембріона через 6 днів після запліднення (dpf). Шкала ваги 1мм.

Таблиця 1.

Ідентифікація Fus методом мас-спектрометрії (MS). Пептиди, унікальні для білка Fus, були ідентифіковані лише в аналізі РС ембріонів WT 5dpf та мозку дорослих, але не в нокауті Fus. Хрестик (х) означає, що пептид був ідентифікований у відповідному зразку. Внизу: Повна послідовність білка Fus, виявлені унікальні для Fus пептиди виділені жирним шрифтом та підкреслено.

дикий тип				fus -/-
Зразок	Послідовність	репл. 1	репл. 2	репл. 3	репл. 4	репл. 1	репл. 2	репл. 3	репл. 4
Ембріон	AAIDWFDGKDFNGNPIK	X
	TGLPMINLYTDR	X	X
Мозок	AAIDWFDGKDFNGNPIK	X	X	X	X
	CSNPSCGNLNFSWR	X	X	X
	TGLPMINLYTDR	X

MASNDYGQTSSHGYGGYGGQSGQSYSQPSAQNYSQQSYGGYNQSSESSSAPYNQGGYSSNYGQSQSGGYGSQAPSQGYSQSSQSYSSGGYSNTSQPPPAQSGGYSQQSSYSGYNQSSPASAPGGYSSSSQSSGYGQQQQQSGGGYGGSGGQSGGYGSSGGQSSGFGGSGGQHQSSQSGGGSYSPSPNYSSPPPQSYGQQSQYGQGGYNQDSPPMSGGGGGGGYGGQDGGYSQDGRGGRGRGGGFGGRGAGGFDRGGRGGPRGRGGMGMGDRGGFNKFGGPRDHGAGGPNMQEQDNSDNNTIFVQGLGDDYTVDSVADYFKQIGIIKVNKKTGLPMINLYTDRETGKLKGEATVSFDDPPSAKAAIDWFDGKDFNGNPIKVSFATRRAEFGRGGSSGGMRGGRGRGGPMGRGGFGGGRGGGGGGGGFQGNNGGGSGNGGGQQRAGDWKCSNPSCGNLNFSWRNECNQCKEPKPEGSGGGMSPMGGGFGGERGRSGFDRGGFRGRGGDRGGFRGGRGGDRGGFGPGKMDSRGDHRHDRRDRPY

---