HGF покращує жирну печінку, спричинену дієтою, Американський фізіологічний журнал - Шлунково-кишковий тракт
Анотація
Фактор росту гепатоцитів (HGF) надає різний вплив, особливо на клітини епітелію. Однак точна роль HGF у ліпогенезі досі не до кінця зрозуміла. Дієта з високим вмістом жиру вводилася трансгенним мишам HGF та контрольним мишам дикого типу in vivo. Крім того, рекомбінантний HGF людини (rhHGF) вводили клітинній лінії HepG2 in vitro. Ми провели аналіз факторів, що стосуються ліпідного обміну. Надмірна експресія HGF різко покращує жирну печінку, спричинену дієтою. Трансгенні миші HGF продемонстрували очевидно знижене накопичення ліпідів у печінці. Активація мікросомного білка переносу тригліцеридів (MTP) та аполіпопротеїну B (ApoB), що супроводжує більш високі рівні тригліцеридів у сироватці крові, була виявлена у трансгенних мишей HGF на звичайній дієті. Цікаво, що це підвищення регуляції активації МТФ стало більш очевидним у дієті з високим вмістом жиру. Крім того, введення rhHGF стимулювало експресію MTP та ApoB, одночасно знижуючи знижений вміст внутрішньоклітинних ліпідів у клітинній лінії HepG2. Однак ця індукція MTP та ApoB за допомогою HGF була чітко пригнічена PD98059 (інгібітор MAPK). На закінчення дані, представлені в цьому дослідженні, показали, що HGF покращує жирову печінку, спричинену дієтою, завдяки активації MTP та ApoB.
жирова печінка - поширене захворювання у пацієнтів, що супроводжується ожирінням та діабетом, і однією з основних причин розвитку ожиріння та діабету у людей є дієта з високим вмістом жиру.
Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) зростає як стан, який з часом переростає в кінцеву стадію захворювання печінки. Патологічна картина нагадує картину алкогольної травми печінки, але вона спостерігається у пацієнтів, які не зловживають алкоголем. NAFLD вражає 10–24% загальної сукупності в різних країнах. Поширеність зростає до 57,5–74% серед людей із ожирінням (1).
Хоча пропонуються різні способи лікування цієї хвороби (7, 21), не доведено, що певні ліки безпосередньо покращують НАЖХП.
НАЖХП - це пошкодження печінки, при якому гістопатологічні відхилення імітують алкогольний стеатогепатит (19). Нещодавно було показано, що введення фактора росту гепатоцитів (HGF) покращує жирність печінки з алкоголем (28, 29), проте точний вплив HGF на НАЖХП ще потрібно з'ясувати. Тому ми дослідили, чи може введення HGF бути ефективним для поліпшення НАЖХП.
HGF - це поліпептид, який спочатку характеризувався як високопотужний мітоген гепатоцитів (10, 20). Недавні дослідження показали, що HGF є багатофункціональним цитокіном, який може викликати мітогенні, мотогенні та морфогенні реакції у різноманітних культивованих клітинах епітелію, що експресують трансмембранний рецептор тирозинкінази, c-Met (5, 38).
Ми розробили та підтримували трансгенну лінію HGF та розкрили кілька фенотипів (25, 30, 32). За допомогою цієї моделі миші ми дослідили вплив HGF на НАЖХП при дієті з високим вмістом жиру. Більше того, подальші дослідження привели до розуміння того, що поліпшення алкогольної травми печінки супроводжувалось регуляцією мікросомального білка переносу тригліцеридів (МТФ) та аполіпопротеїну В (АпоВ) (28, 29). Тому ми провели подальшу експертизу наступним чином, використовуючи MTP та ApoB у моделі NAFLD.
МТФ є обмежуючим швидкістю фактором для виробництва ApoB-вмісних ліпопротеїдів дуже низької щільності (12, 18, 37). МТФ - це ексклюзивний внутрішньоклітинний білок (12), і його основна роль полягає в перенесенні ліпідів на поліпептиди ApoB в ендоплазматичній сітці клітин, що секретують ліпопротеїни (12).
У цьому документі ми продемонстрували, що надмірна експресія HGF різко покращила жирну печінку, спричинену дієтою, з високим вмістом жиру in vivo. Крім того, ми показали, що цей захисний ефект HGF обумовлений активацією MTP та ApoB.
Трансгенні миші та лікування.
Трансгенні миші (Tg), у яких експресія кДНК мишачого HGF була зумовлена промотором металотіоїну та областями контролю локусу, генерувались на генетичному тлі виродженого альбіноса FVB/NCr (далі - FVB), як описано раніше (30) . Крім того, Takayama et al. продемонстрували, що трансген HGF експресується у всіх органах і існує ряд фенотипів, таких як гепатомегалія, кістозна хвороба, що супроводжується вогнищевим сегментарним гломерулосклерозом, виразки, пов'язані з хронічним активним запаленням прямої кишки тощо (25, 31–33).
Були використані шість-8-тижневі самці мишей дикого типу Tg та FVB (WT). Усі дослідження на тваринах проводились згідно з керівництвом з догляду та використання тварин, встановленим Інституційною комісією з огляду Вищої медичної школи університету Гунма. WT і Tg поміщали після відлучення (3 тижні) на дієту з високим вмістом жиру (60% калорій, отриманих з жиру; D12492, Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі), або на звичайну дієту чау (10% отриманих калорій з жиру; D12450B, Дієти дослідження). Мишей годували парами на цих дієтах протягом 4 тижнів.
Біохімічний та гістологічний аналіз.
Ліпіди екстрагували з 50 мг гомогенату печінки, і концентрацію ліпідів на вологу масу печінки вимірювали згідно з методикою, описаною раніше (9). Для гістологічного аналізу тканину печінки фіксували у 4% параформальдегіді та вбудовували у парафін. Альтернативно, печінкові ліпіди фарбували методом Oil Red O. Для аналізу білка або РНК зразки тканин заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 ° C до використання. Концентрації аланінамінотрансферази (АЛТ), тригліцеридів та глюкози в сироватці крові вимірювали за допомогою стандартного клінічного автоаналізатора (Hitachi 7170; Hitachi, Токіо, Японія). Рівень інсуліну в сироватці крові визначали за допомогою набору для радіоімуноаналізу інсуліну (Shionogi, Osaka, Japan) відповідно до інструкцій виробника. Рівень глюкози та інсуліну в сироватці крові вимірювали за допомогою зразків, вилучених через 12 год голодування.
ApoB в сироватці крові або середовищі визначали за допомогою набору ApoB ELISA (ALerCHEK, Portland, ME) відповідно до інструкцій виробника.
РНК-аналіз.
Клітина гепатокарциноми людини, HepG2, була отримана з Американської колекції типових культур (Манассас, штат Вірджинія). Клітини HepG2 (2 × 105) висівали в 35-міліметровий посуд протягом 24 годин, середовище обмінювались безсироватковою DMEM (GIBCO BRL, Grand Island, NY), а потім клітини інкубували протягом ночі. Крім того, ці клітини інкубували протягом 6 год з 40 нг/мл рекомбінантного людського HGF (rhHGF; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота), з або без 20 мкМ інгібітора MAPK, PD98059 (Sigma-Aldrich Japan KK, Токіо, Японія), або інгібітор фосфатидилінозитол 3-кінази (PI3K), вортманінін (Sigma-Aldrich Japan KK), за 1 год до стимуляції HGF. Методи збору РНК, RT-PCR та ПЛР у реальному часі з використанням тканини або клітин печінки мишей були описані раніше (17). Деталі послідовності наведені в таблиці 1.
Таблиця 1. Послідовності пар праймерів, що використовуються для ампліфікації мРНК методом ПЛР у реальному часі
SREBP, білок, що зв’язує регулюючий елемент стеролу; G6PD, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа.
Експерименти з мікрочипами.
Печінкова активність МТП.
Активність MTP печінки визначали за допомогою комерційного набору, заснованого на опосередкованому MTP перенесенні самозагашеного флуоресцентного нейтрального ліпіду з ядра донорської частинки в акцепторну частинку (Roar Biomedical, New York, NY).
Аналіз білка ApoB.
Для імунопреципітації 1000 мкг лізату тканини печінки інкубували з анти-ApoB антитілом (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) протягом 2 годин на льоду. Після додавання Gamma-Bind G Sepharose (Boehringer Mannheim, Mannheim, Німеччина) та промивання в буфері RIPA, імунопреципітати фракціонували на 10% поліакриламідних гелях (BIOCRAFT, Токіо, Японія). Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано раніше (17).