Хронічна дієта з високим вмістом жиру порушує збір функції лімфатичних судин у мишей
Катрін С. Блюм
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Синем Караман
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Стівен Т. Проулкс
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Олександра М. Оксенбейн
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Паола Лучані
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Жан-Крістоф Леру
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Крістіан Вольфрум
2 Інститут харчування, харчування та здоров'я, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Шверценбах, Швейцарія,
Майкл Детмар
1 Інститут фармацевтичних наук, Швейцарський федеральний технологічний інститут, ETH Цюріх, Цюріх, Швейцарія,
Задумав і спроектував експерименти: KSB SK STP CW MD. Виконував експерименти: КСБ СК СТП. Проаналізовано дані: KSB SK STP MD. Внесені реагенти/матеріали/інструменти для аналізу: AMO PL JCL. Написав папір: KSB SK STP MD.
Пов’язані дані
Анотація
Вступ
Ми мали на меті дослідити, як і як ожиріння, спричинене дієтою, впливає на морфологію та функцію лімфатичної судини. З цією метою мишей годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD), а потім ми проводили морфометричні оцінки лімфатичних судин і використовували візуалізацію ближнього інфрачервоного випромінювання з високою роздільною здатністю для кількісного дослідження функції збору лімфатичних судин у задній частині мишей in vivo. У трьох різних штамах мишей ми виявили, що HFD асоціюється з порушенням функції збору лімфатичних судин. Ці результати свідчать про те, що дисфункція лімфатичної системи може бути спричинена розширенням жирової тканини.
Матеріали і методи
3.1 Моделі тварин - Заява про етику
Самці C57BL/6J: мишей ICR (n = 20), мишей FVB (n = 16) та мишей K14-VEGF-C [13] (n = 8) утримували в звичайних умовах SPF. Для кожного штаму, починаючи з 4-тижневого віку, половині мишей був наданий доступ до стандартного чау (чау; 11% ккал від жиру, 31% ккал від білка та 58% ккал від вуглеводів; Provimi-Kliba, Kaiseraugst, Швейцарія), а друга половина - до дієти з високим вмістом жиру (HFD; 60% ккал від жиру, 20% ккал від білка та 20% ккал від вуглеводів; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA) протягом 17 тижнів або 31 тиждень. Мишей знеболювали i.p. ін’єкція 0,2 мг/кг медетомідину та 80 мг/кг кетаміну для візуалізації. Мишей жертвували передозуванням анестезії (1000 мг/кг кетаміну/3,5 мг/кг медетомідину) з подальшим вивихом шийки матки. Всі експерименти проводились відповідно до протоколів на тваринах, затверджених Kantonales Veterinäramt Zürich.
3.2 Аналіз вмісту води
Вміст води аналізували, як описано раніше [9]. Коротко, зразки шкіри спини збирали за допомогою біопсійних штампів 6 мм (Acuderm, Fort Lauderdale, FL, USA). Зразки зважували після збору і висушували ліофілізацією протягом 24 годин. Після цього зразки знову зважували і обчислювали втрату ваги. Оскільки ця процедура видаляла воду з тканин, втрата ваги представляла вміст води в тканині.
3.3 Гістологічний та імунофлуоресцентний аналізи
Кріосекції хвостів (7 мкм) фіксували протягом 2 хв в ацетоні (–20 ° C) і протягом 5 хв у 80% метанолі (4 ° C), промивали в PBS і інкубували протягом ночі (4 ° C) з хом'ячком проти -подопланінові антитіла (клон 8.1.1, Дослідження розвитку Hybridoma Bank, Університет Айови) та антитіла до Meca32 щурів (1-200, BD Pharmingen, Allschwil), або кролячі анти-LYVE-1 (1-600, AngioBio) та щурячий анти-CD31 (1∶200, BD Pharmingen). Потім зразки інкубували протягом 30 хв з кон’югованими Alexa488- і Alexa594 вторинними антитілами (1∶200) та Hoechst 33342 (1∶1000; усі з Invitrogen, Базель, Швейцарія). Регулярне фарбування гематоксиліном застосовували для фарбування парафінових зрізів (8 мкм) хвоста.
3.4 Морфометричний та морфологічний аналізи
Імунофлуоресцентні плями зрізів шкіри хвоста для позитивних до подопланіну лімфатичних судин та судин, позитивних до Meca32, досліджували на мікроскопі Axioskop 2 mot plus (Carl Zeiss, Фельдбах, Швейцарія), а також зображення 3 - 5 окремих полів зору на секцію були придбані за допомогою камери AxioCam MRc із об'єктивом Plan-APOCHROMAT 10 ×/0.45 NA та програмним забезпеченням AxioVision 4.7.1 (Carl Zeiss, Feldbach, Швейцарія). Товщину епідермісу, дерми та жирової тканини визначали на парафінових зрізах шкіри хвоста, пофарбованих гематоксиліном. Морфометричний аналіз судин та товщини тканин проводили за допомогою програмного забезпечення ImageJ [14].
3.5 Імунозабарвлення цілого кріплення
3.6 Візуалізація функції лімфатичних судин in vivo
Для лімфатичної візуалізації був використаний стереомікроскоп Zeiss StereoLumar.V12, пристосований для візуалізації NIR [15]. Відео записували під час внутрішньошкірного введення лімфоспецифічних індикаторів P20D680 або P40D680 у стопу [15]. Додаткові відеозаписи для візуалізації скоротливості збору лімфатичних судин, що дренують нижню кінцівку, були отримані до і після механостимуляції місця ін'єкції. Механостимуляцію проводили за допомогою ватного тампона, який обережно натискали на місце ін’єкції один раз на секунду протягом десяти секунд, щоб стимулювати початкове поглинання лімфосигналізатора та продемонструвати здатність лімфатичної системи реагувати на раптове навантаження рідини [15]. Для оцінки частоти накопичення скорочень лімфатичних судин проводили аналіз інтенсивності флуоресценції (ROI). Реакцію на механостимуляцію оцінювали, визначаючи кратну зміну середньої інтенсивності флуоресценції протягом 30 с періоди безпосередньо перед механостимуляцією і починаючи з 30 с після механостимуляції.
3.7 Аналіз перфузійної ділянки шкіри
Два-три NIR-зображення задньої кінцівки поєднувались разом, щоб отримати огляд всієї ноги - включаючи щиколотку і дистальну третину верхньої частини ноги - за допомогою програмного забезпечення Photoshop v 5.0 (Adobe Systems). Прямокутний ROI шириною 6 мм і висотою 15 мм розміщували на знімку NIR, приймаючи за орієнтир середню точку дуги спинного лімфатичного судини, і зображення обрізали. Потім загальну площу шкіри та проникну фарбою ділянку на обрізаному зображенні вимірювали вручну, використовуючи інструмент полігонального ласо в програмному забезпеченні Photoshop. Потім зону перфузії розраховували як відсоток від загальної площі шкіри.
3.8 Статистичний аналіз
Усі дані відображаються як середнє значення ± SD. Засоби груп порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента; Корекція Уелча застосовувалась у випадку неоднакових дисперсій, а для порівняння ненормально розподілених даних використовувався U-тест Манна-Уітні. P Рисунок 1A). Вміст води в шкірі спини зменшився через 17 тижнів при HFD (FVB: HFD, 0,41 ± 0,11 мл/г проти чау, 0,53 ± 0,10 мл/г; P = 0,0405; C57BL/6J: ICR: HFD, 0,34 ± 0,06 мл/г проти чау, 0,53 ± 0,06 мл/г; Р = 0,0013; Малюнок 1В). У хвостах було виявлено значне збільшення жирової тканини з гіпертрофічними адипоцитами (малюнки 1С та D) (товщина підшкірного шару в HFD, 269,5 ± 18,4 мкм проти чау, 150,8 ± 15,9 мкм; P Рисунок 1E).
Значно збільшилася маса тіла (A) та зменшився вміст води у шкірі в спині (B) після 17 тижнів HFD. Фарбування гематоксиліном (C, D) та кількісний аналіз зображень (E) виявили значно збільшену товщину жирової тканини, але не епідермісу або дерми, в шкірі хвоста мишей C57BL/6J: ICR HFD. Імунофлуоресцентні плями для подопланіну (F, G; червоний; лімфатичні судини) та Meca32 (H, I; зелений; кровоносні судини) та кількісний аналіз зображень (J) виявили зменшення середнього розміру шкірних лімфатичних судин, але не розміру кровоносних судин, після HFD. Шкала шкал = 100 мкм. Дані представляють середнє значення ± SD. * P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001.