Ідентифікація слинних та плазмових біомаркерів на ожиріння у дітей за нецільовим методом
Анотація
Хімічні сполуки в слині, які, найімовірніше, пов’язані з ожирінням, виявляються під час метаболомічного аналізу парних зразків цілої слини та плазми у 68 дітей (10-річного віку), яких також оцінювали на предмет почервоніння ясен.
Результати Завдяки метаболомічному аналізу119 сполуки були виявлені лише в слині, 210 лише в плазмі та 126 в обох. Найпоширенішими метаболітами плазми були ліпіди. Найпоширенішими метаболітами слини були пептиди. Амінокислоти та їх метаболіти були поширеними в обох зразках.
Сурогатні показники визначали шляхом обчислення кореляційних зв'язків між слиною та плазмою. 29 із 126 виявлених як у слині, так і в плазмі мали значну позитивну кореляцію, і лише 4 з них (урати, креатинін, піпеколат та гідроксипролін) були пов’язані з ожирінням як потенційними сурогатними біомаркерами. Уремічний токсин N1-метил-2-піридон-5-карбоксамід (2PY) також був підвищений у слині дітей із ожирінням. 21 біохімічна речовина була підвищена як при ожирінні, так і при гінгівіті, що свідчить про те, що деякі біохімічні шляхи розвитку гінгівіту та ожиріння є спільними.
З метаболітів, виявлених лише у слині, 35 були пов’язані з ожирінням (пробірки для зберігання р ® 2D із кодованим штрихкодом ScrewTop ®, Thermo Fisher Scientific Inc., Хадсон, штат Нью-Гемпшир) і зчитувалися за допомогою зчитувача штрих-кодів (Thermo Scientific VisionMate ® ST Считувач штрих-кодів, Thermo Fisher Scientific Inc., Хадсон, штат Нью-Гемпшир), за яким номер учасника співвідносився з номером вибірки.
Кров відбирав флеботоміст із серединної ліктьової артерії (BD Hemogard plus, K2 BD367863, лавандова кришка), центрифугував 10 хвилин при 2000 х г у холодильній центрифузі. Зразки слини та плазми зберігали до -80 ° C до аналізу.
Клінічні оцінки
Усі клінічні оцінки проводились підготовленими експертами. Висоту вимірювали стадіометром, а вагу - каліброваною вагою у ванній кімнаті. Артеріальний тиск і частоту серцевих скорочень вимірювали за допомогою автоматичного зчитування манжети після того, як діти 10 хвилин спокійно сиділи. Стоматологічні вимірювання проводили за допомогою переносного дитячого стоматологічного крісла, внутрішньоротового світла та ротового дзеркала. Гінгівіт оцінювали шляхом підрахунку кількості червоних ділянок ясен (мезіальних, щічних, дистальних та мовних кожних зубів) стоматологічним персоналом. Розпад зубів оцінювали шляхом підрахунку кількості зубів (як молочних, так і постійних), які мали видимий карієс або були заповнені. У цьому дослідженні не використовувались ні зубні зонди, ні рентгенограми.
Метаболомічний аналіз
Аналізували аликвоти 120 мкл супернатантів слини та зразків плазми від кожного учасника. Відносні кількості кожного метаболіту отримували інтегруванням піків, виявлених на нецільовій метаболічній платформі профілювання (Metabolon®, Durham, North Carolina), використовуючи високоефективну рідинну хроматографію/тандемну мас-спектрометрію (HPLC-MS/MS та газову хроматографію-мас-спектрометрію) MS) для летких видів [2]. З'єднання ідентифікували шляхом узгодження хроматографічного часу утримання та підписів мас-спектральної фрагментації з даними бібліотеки посилань, створених на основі справжніх стандартів.
Аналіз даних
Всі 455 біохімічних речовин, виявлених у слині, плазмі або обох, пройшли три рівні аналізу. Першим аналізом було визначити, чи біохімічна речовина слини може бути сурогатом плазми. Другий аналіз полягав у визначенні того, чи передбачає біохімік ожиріння. Третім аналізом було визначити біохімічний прогноз гінгівіту, гіпертонії або карієсу зубів. Інформація про пацієнта та кількісні дані цього дослідження наведені в додаткових таблицях. Таблиця S1 містить клінічні категоричні дані. Таблиця S2 містить дані для слини, а таблиця S3 - дані для плазми. Тільки ті біохімікати з р-значеннями для ожиріння ≤ 0,01 були збережені в таблицях основного тексту.
На первинному рівні був проведений аналіз для визначення кореляції між рівнями слини та рівнями плазми крові, що ідентифікує ті біохімікати в слині, які можуть бути безпосередньо пов’язані з плазмою. Цей аналіз, якщо позитивний та значущий, вказує на те, чи існує позитивний коефіцієнт розподілу між відділами плазми та цілої слини. Якщо вони негативні або незначні, то, ймовірно, немає взаємозв’язку між рівнем слини та плазми крові, так що ці змінні навряд чи є сурогатними кандидатами. Однак це передбачає, що концентрація як у слині, так і в плазмі знаходиться в межах чутливості до вимірювання за допомогою мас-спектрометричного методу.
На середньому рівні здатність передбачати, чи страждає ожиріння, перевіряється непараметричною статистикою (U-тест Манна-Уітні). Якщо цей показник був значним, біохімічна речовина була визначена як потенційний біомаркер для ожиріння. Якщо ні, його відкидали. Цей аналіз був доповнений визначенням площі під робочою кривою приймача (AUROC). Цей показник є узагальненим показником точності кількісного діагностичного тесту, який можна інтерпретувати як середню чутливість для всіх можливих значень специфічності [3]. Значення для AUROC визначали з метаболомічних даних за допомогою програмного забезпечення MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/).
Для третього рівня за допомогою непараметричної статистики перевірялася здатність передбачати, чи має суб’єкт гінгівіт, карієс зубів або високий кров’яний тиск. Результати вказують, чи будь-яка біохімічна речовина (у слині чи плазмі) була потенційним біомаркером для цих захворювань та чи не суперечило це виявленню ожиріння.
Клінічна оцінка: У дитини з ожирінням було визначено, що вона має ≥95-й процентиль за індексом маси тіла (ІМТ) (https://nccd.cdc.gov/dnpabmi/Calculator.aspx). Дитина з гінгівітом визначалася як така, у якої більше середнього відсотка червоних ділянок ясен (10,6% ділянок червоних). Діти з карієсом визначались як діти з будь-яким видимим карієсом на будь-якому зубі. Гіпертонічну хворобу визначали як систолічний артеріальний тиск ≥ 130 мм рт.ст.
Результати і обговорення
Демографія пацієнта
З 68 обстежених дітей (таблиця 1) 22 страждали ожирінням (16 чоловіків, 6 жінок) і 46 не страждали ожирінням (6 чоловіків, 40 жінок) із середнім віком 10,7 ± 0,2 року. Середній ІМТ, окружність талії, маса тіла, гіперемія ясен, зріст, вік та систолічний артеріальний тиск у дітей із ожирінням були значно більшими у дітей із ожирінням. Не було помічено різниці в діастолічному артеріальному тиску чи карієсі.
Антропоморфні та клінічні характеристики досліджуваної популяції, згруповані за ожирінням. Перераховані значення є середнім значенням ± стандартна помилка. p-значення відносяться до аналізу за допомогою t-критерію.
Поширення біохімікатів
У зразках супернатанту плазми та центрифугованої слини було виявлено загальну кількість 455 унікальних біохімікатів (рис. 1). 119 (26%) виявлено лише у слині, 210 (46%) виявлено лише у плазмі та 126 (28%) виявлено як у плазмі, так і в слині.
Більшість біохімічних речовин, які є спільними між слиною та плазмою, були амінокислотами та їх метаболітами (рис. 1). У слині пептиди були найбільш часто зустрічаються біохімічними речовинами. У плазмі найпоширенішими були ліпіди. 109 (77%) видів ліпідів, виявлених у плазмі, не виявлено в слині, а 48 (91%) пептидів, виявлених у слині, не виявлено в плазмі.
Аналіз на ожиріння, гінгівіт, карієс та артеріальну гіпертензію продемонстрував, що ожиріння найбільше представлене як метаболітами слини, так і плазми (рис. 2). Ожиріння було достовірно (р ≤ 0,01) пов’язане з 39 біохімічними речовинами як за допомогою аналізу слин (таблиця 3), так і для 64 методом аналізу в плазмі крові (таблиця 4).