Інтерактивний вплив неперетравних вуглеводів, типу білка та рівня білка на біомаркери

Афілійований відділ одношлункового харчування Інституту фізіології та харчування тварин імені Кіелановського Польської академії наук, Яблонна, Польща

Афілійований відділ одношлункового харчування Інституту фізіології та харчування тварин імені Келановського Польської академії наук, Яблонна, Польща

Марцін Тацяк,
Марцін Барщ,
Анна Тусніо,
Барбара Пастушевська

Цифри

Анотація

Цитування: Taciak M, Barszcz M, Tuśnio A, Pastuszewska B (2015) Інтерактивні ефекти неперетравних вуглеводів, типу білка та рівня білка на біомаркери здоров’я великих кишок у щурів. PLoS ONE 10 (11): e0142176. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142176

Редактор: Міхай Коваса, Західний університет наук про здоров'я, США

Отримано: 10 грудня 2014 р .; Прийнято: 18 жовтня 2015 р .; Опубліковано: 4 листопада 2015 року

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Це дослідження було фінансово підтримане Міністерством науки та вищої освіти Польщі, грант № N N311 046634. Фінансисти не відігравали ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Матеріали і методи

Тварини та дієти

Вимірювання рН і SCFA дигести

РН Digesta вимірювали за допомогою pH-метра WTW/340 рН-метра (WTW GmbH, Weilheim, Німеччина), а аналіз SCFA проводили за допомогою газового хроматографа HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germany) з ізокапроновою кислотою як внутрішнім стандартом [9].

Аналіз фенолу та р-крезолу

Концентрації фенолу та р-крезолу в цекальній дігесті оцінювали на основі раніше описаних методів [10] із наступними модифікаціями. Кожну пробу (1,0 г) змішували з 1,5 мл метанолу та інкубували протягом 1 години на льоду з частими вихорами. Після інкубації зразки центрифугували при 12000 об/хв протягом 15 хв при 4 ° C. Супернатант (500 мкл) переносили у флакони та змішували з 15 мкл 5-метиліндолу як внутрішнього стандарту. Далі він був проаналізований за допомогою газового хроматографа HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Waldbronn, Німеччина) з полум’яно-іонізаційним детектором та капілярною колоною з кварцевого кремнезему Supelco Nukol ™ (Supelco, Bellefonte, США) (ID 60 м × 0,32 мм; 0,25 мкм). Температуру в духовці встановлювали на 55 ° C протягом 1 хв, потім підвищували до 180 ° C зі швидкістю 20 ° C/хв і витримували протягом 25 хв. Потім температуру підвищували до 200 ° C при 20 ° C/хв і витримували протягом 27 хв. Температури інжектора та детектора становили 220 ° C, а в якості газу-носія використовувався гелій. Загальний час роботи 60,25 хв. Концентрації фенолу та р-крезолу розраховували на основі стандартних кривих.

Аналіз β-глюкуронідази

Активність β-глюкуронідази у зразках розщепленого кишечника визначали спектрофотометрично [9] на основі кількості фенолфталеїну, що виділяється із субстрату (фенолфталеїн β-D-глюкуронід). Поглинання вимірювали при 540 нм за допомогою спектрофотометра Unicam UV 300 (Thermo-Spectronic, Кембридж, Великобританія).

Аналіз аміаку

Концентрація аміаку в вмісті товстої кишки була кількісно визначена спектрофотометрично на основі реакції іона амонію з реактивом Несслера. Зразок (0,5 г) змішували з 2 мл надчистої води, підкислювали 1М HCl для регулювання рН до 5,0-6,0 та гомогенізували протягом 30 с на високій швидкості. Потім зразки центрифугували при 10000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° С. Надосадову рідину (1,0 мл) переносили в нову пробірку та інкубували приблизно з 0,18 г основного карбонату магнію протягом 20 хв при кімнатній температурі з частим перемішуванням для видалення іонів заліза, що могло спотворити результати аналізу. Після інкубації зразки центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв. Потім були виконані наступні кроки з використанням мультидисциплінарної діагностичної платформи Maxmat PL (Erba Diagnostics France SARL, Монпельє, Франція). Супернатант (5 мкл) поміщали на мікропланшет для титрування, розбавляли 220 мкл надчистої води і змішували з 25 мкл реагенту Несслера. Поглинання вимірювали негайно при 425 нм, і концентрацію амонію розраховували за стандартною кривою, підготовленою з використанням розчину хлориду амонію.

Гістологія сліпої та кишки

Зразки тканин вкладали у парафін, розрізали на ділянки 5 мкм і фарбували гематоксиліном та еозином. Глибину крипти та товщину міентерона (15 вимірювань на предметне скло, два предметних стекла на зразок) вимірювали за допомогою світлового мікроскопа Zeiss Axio Star Plus (Carl Zeiss, Геттінген, Німеччина) та програмного забезпечення для аналізу зображень Axio Vision LE Release 4.5 (Carl Zeiss, 2002– 2005).

Виділення колоноцитів та аналіз лужної комети

Аналіз лужної комети проводили згідно з інструкціями виробника з використанням Trevigen CometSlide TM (Trevigen, Гейтерсбург, штат Медіка, США) та апарату горизонтального електрофорезу. Зображення комет візуалізували за допомогою фарбування бромідом етидію (2 мкг/мл) та аналізували при збільшенні 40X, використовуючи флуоресцентний мікроскоп Olympus BX51 (Olympus Corp., Токіо, Японія), оснащений збуджуючим фільтром 510–550 нм та бар’єрним фільтром 590 нм . Комети аналізували за допомогою програмного забезпечення для зображення Cell D (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Мюнстер, Німеччина). Для кожної вибірки 75 випадково відібраних комет було віднесено до п’яти класів від 0 (неушкоджених) до 4 (максимально пошкоджених). “Інтенсивність хвоста” виражалась у довільних одиницях [11] і становила від 0 до 400.