JCI - цілеспрямоване порушення рецепторів Н3 призводить до змін тонусу гістаміну мозку, що призводить до

Кадзухіко Такахасі, Хіроакі Сува, Томоо Ісікава та Хідехіто Котані

Функціональна геноміка, Науково-дослідний інститут Баню Цукуба у співпраці з дослідницькими лабораторіями Мерка, Цукуба, Ібаракі, Японія

Адресна кореспонденція: Хідехіто Котані, Науково-дослідний інститут Баню Цукуба, Окубу 3, Цукуба, Ібаракі, 300-2611, Японія. Телефон: 298-77-2202; Факс: 298-77-2027; Електронна пошта: [email protected].

Знайдіть статті Такахасі К. у: JCI | PubMed | Google Scholar

Знайдіть статті Ісікави, Т. у: JCI | PubMed | Google Scholar

Опубліковано 15 грудня 2002 р. - Докладніше

Гістамін є сильнодіючою біоактивною речовиною, яку вивчали майже століття. Гістамін зберігається в тучних клітинах периферичних тканин, а вивільнення гістаміну є частиною патогенезу різних запальних реакцій (1 - 3). Також гістамін є амінергічним нейромедіатором, який локалізується в ЦНС та периферичній нервовій системі. Гістамінергічні нейрони розташовуються виключно в туберомаммілярному ядрі (TM) заднього гіпоталамуса і проектують свої аксони в області мозку, включаючи гіпоталамус, таламус, кору головного мозку, мигдалину та перегородку (4 - 7).

Аналіз генотипування Саузерн-блот. Ми використовували 865-bp і 965-bp-фрагменти, розташовані поза вектором націлювання на 5 'і 3' стороні, як зонди для скринінгу для правильно націлених клонів ES клітин та наступних мутантних мишей. Цілеспрямоване порушення послідовності, що кодує рецептор H3, за допомогою касети резистентності PGK-neo ввів додатковий сайт BamHI. Отже, 5 'і 3' зонди виявили фрагменти BamHI приблизно 12 kb і 8,5 kb відповідно з клітин ES, що містять алель цільового рецептора H3.

Аналіз складу тіла. Жирову масу та худу масу тіла вимірювали, як описано раніше (33); Миші самців від 20 до 25 тижнів та жінки від 16 до 17 тижнів ( = 3 або 4).

Аналіз експресії H1, H2 та H3. Вестерн-блот-аналіз проводили з використанням 4 мкг загальної РНК мозку для Н3 та 4 мкг мРНК мозку для гібридизацій Н1 та Н2. Зонд для гібридизації складався з кДНК миші H3 (позиції 432–1116), кДНК H1 людини (позиції 190–977), кДНК людини H2 (позиції 231–1026) та GAPDH людини (позиції 586–1037).

Аналіз виразу UCP1, UCP2 та UCP3. Загальну РНК виділяли з коричневої жирової тканини (BAT), білої жирової тканини (WAT) та скелетних м’язів. П’ять мікрограмів загальної РНК аналізували за допомогою Норт-блоттингу. Зонди для гібридизації складалися з кДНК миші UCP1 (позиції 745–1005), кДНК миші UCP2 (позиції 870–1177) та кДНК миші UCP3 (позиції 212–542). Вимірювання денситометрії проводили FUJIX BAS2000 (Fuji-film, Токіо, Японія) та нормалізували за допомогою GAPDH.

Вимірювання рухової активності. Ми оцінили рухову активність індивідуально утримуваних мишей від 16 до 21 тижня ( = 9–11) із системою фотопроменів у клітці (15 × 25 × 12 см) (Neuroscience, Токіо, Японія). Всі вимірювання проводились протягом 4 днів у кожній групі. Вимірювання, проведені за останні 3 дні, використовувались для аналізу даних.

Аналіз крові. Для тестів на толерантність до глюкози миші-жінки від 26 до 28 тижнів ( = 4–6) голодували протягом 14 годин і вводили глюкозу (2 г/кг) за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції. Для тесту на толерантність до інсуліну людський інсулін (0,75 Од/кг; Novo Nordisk, Bagsværd, Данія) вводили внутрішньочеревно мишам від 26 до 28 тижнів ( = 4–6), які голодували 3 години. Кров відбиралася з хвоста у зазначений час. Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою AntsenseII (Daikin, Osaka, Japan). Рівні лептину та інсуліну в плазмі крові вимірювали методом ІФА (Morinaga, Йокогама, Японія). Для вимірювання рівня Т4 без плазми використовували комерційні набори радіоімунологічного аналізу (Dainabot, Токіо, Японія). Колориметричні аналізи використовували для вимірювання холестерину, триацилгліцерину (TG; KYOWA, Токіо, Японія) та FFA (Wako, Токіо, Японія). Вік тварин під час тестування був таким (для мишей-самців та самок відповідно): для лептину, інсуліну та Т4, 11–18 та 13–16 тижнів; для FFA та холестерину, 11–20 та 13–16 тижнів; для ТГ, 14–19 та 17–24 тижні; а для глюкози - 8–12 та 13–16 тижнів.

Вимірювання гістаміну/теле-метилгістаміну. Мишей обезголовили без ін'єкції паргіліну, а їх мозок швидко видалили, помістили на лід і розділили на п'ять областей: передній мозок (включаючи кору та смугастий кіст), гіпокамп, гіпоталамус/таламус, стовбур мозку та мозочок. Зразки мозку зважували та гомогенізували в 10 об. 0,2 н. Хлористоводневої кислоти за допомогою ультразвуку. Гомогенат центрифугували при 10000 g протягом 5 хвилин при 4 ° C. Надосадову рідину нейтралізували (до рН 7–8) 1 М боратним буфером (рН 9,25). Самки мишей віком 20–26 тижнів ( = 3) були використані. Ми вимірювали гістамін методом ІФА (Immunotech, Марсель, Франція) та теле-метилгістамін від RIA (Pharmacia Diagnostics, Упсала, Швеція).

Внутрішньоцеребровентрикулярне введення тіопераміду та лептину. Препарати вводили у правий латеральний церебровентрикуляр (0,5 мм ззаду, 1,0 мм з боків та 3,0 мм вентрально від брегми), як описано раніше (34). Тіоперамід (Tocris Cookson), нейропептид Y (NPY; Інститут пептидів, Осака, Японія) та лептин (Genzyme Techne, Міннеаполіс, штат Міннесота, США) були щойно розчинені у фізіологічному розчині та влиті у дозах 100 нмоль, 2 мкг та 0,5 мкг. на мишу відповідно. Споживання їжі вимірювали протягом 2 годин (тіоперамід та NPY) та 24 години (лептин) після інфузії. Об'єм інтрацеребровентрикулярної інфузії реагентів обмежувався загальним об'ємом 5,0 мкл. Мишами, які використовувались для цих експериментів, були миші від 20 до 30 тижнів ( = 9) для тіопераміду та NPY та мишей-самців віком від 18 до 34 тижнів ( = 5) для лептину.

Внутрішньочеревно введення тіопераміду. Тіоперамід (10 мг/кг) і паргілін (65 мг/кг; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) ін'єктували внутрішньочеревно самкам мишей (віком 37-54 тижнів)., = 4) за графіком годування ad libitum. Їх мозок швидко видалили через 90 хвилин після ін’єкції. Цілі мізки були використані для теле-аналіз на метилгістамін.