Короткочасне обмеження калорій покращує відновлення ДНК за рахунок негомологічних кінцевих з’єднань у мишей npj Старіння

Предмети

Анотація

Обмеження калорій (CR) покращує стан здоров'я, зменшує рівень захворюваності на рак та продовжує тривалість життя у багатьох організмів, включаючи мишей. Показано, що CR покращує відновлення базової ексцизії та шляхи відновлення нуклеотидів виправлення ДНК, однак, чи покращує CR репарацію дволанцюжкових розривів ДНК, не досліджували в системі in vivo. Тут ми використовуємо не-гомологічних мишей-репортерів, що приєднують кінці (NHEJ), щоб показати, що короткочасний CR сильно посилює відновлення ДНК NHEJ, що пов'язано з підвищеним рівнем DNA-PK і SIRT6.

Ми створили мишку-репортера, яка дозволяє кількісно вимірювати ефективність NHEJ in vivo, використовуючи ендонуклеазу I-SceI, щоб індукувати розриви дволанцюжкової ДНК в межах касети-репортера NHEJ, інтегрованої в локус ROSA26 19 (рис. 1а). Касета-репортер NHEJ 19 складається з гена GFP, перерваного щурячим інтроном Pem1, який не має гомології з геномом миші, та "вбивчого" екзону, оточеного сайтами I-SceI. GFP інактивується наявністю екзона-вбивці в невпорядкованій конструкції. Скорочення I-SceI призводить до вивільнення екзона-вбивці, тоді як успішна репарація NHEJ релігує інтрон, що призводить до реактивації гена GFP. Події відновлення NHEJ, що відбуваються в межах інтрону, переносять видалення (до 1 кб на кожну сторону розрізу) та вставки без втручання в діяльність GFP.

обмеження

Модель репортерської миші NHEJ пропонує новий інструмент для вивчення впливу CR на ефективність NHEJ in vivo. У попередніх звітах не вивчався вплив короткострокової CR на NHEJ. Слід зазначити, що повідомляється, що 4 тижні CR достатньо для пом’якшення вікових змін в метиломі ДНК 20, припускаючи, що короткочасного CR може бути достатньо для підвищення ефективності відновлення ДНК. У цьому звіті ми використовували мишей-репортерів NHEJ для вивчення впливу короткочасних 40% CR на ефективність NHEJ. Ми виявили, що ефективність NHEJ значно покращилася завдяки короткочасному CR.

Щоб розрахувати добове споживання калорій у мишей-репортерів NHEJ, ми годували мишей ad libitum без пилової точної дієти з гранулами та підраховували кількість споживаних гранул. Миші споживали в середньому 14,3 ± 1,3 ккал на добу під час годування ad libitum і підтримували свою масу тіла (рис. 1б). У групі CR мишей годували 8,4 ккал/день, що дорівнювало 60% середньодобового споживання калорій. Миші CR втрачали масу тіла протягом перших двох тижнів годування, а потім зберігали свою масу тіла (рис. 1в). Усі миші були одинарними, щоб забезпечити рівне споживання їжі. Мишей забивали через 4 тижні від початку дієти. NHEJ вимірювали в первинних клітинах, виділених зі свіжої шкіри, легенів, нирок та мозку мишей. Аналіз NHEJ проводили, як описано раніше 19. Коротко кажучи, клітини ко-трансфікували плазмідою, що кодує фермент I-SceI, для індукції DSB і плазмідою DsRed для нормалізації ефективності трансфекції та аналізували за допомогою проточної цитометрії. Ефективність NHEJ розраховували як відношення GFP + до клітин DsRed +. I-SceI, NHEJ-GFP та DsRed експресуються з промотору CMV. Важливо, що CR не змінював інтенсивності флуоресценції DsRed (додаткова фіг. 1c), припускаючи, що CR не впливає на експресію I-SceI.

Ми виявили, що короткочасний CR значно підвищує ефективність NHEJ у шкірі, легенях, нирках та тканинах мозку порівняно з мишами, що харчуються ad libitum у шкірі, легенях, нирках та мозку (рис. 1г). Це збільшення було пов’язане з підвищеним рівнем ДНК PK (рис. 1e, f) та SIRT6 (рис. 1e, g). Ці результати вказують на те, що короткострокової CR є достатньою для посилення NHEJ.

Дуже великі делеції можуть поширюватися в область кодування GFP і призвести до втрати сигналу. Хоча теоретично лікування CR може змінити вірність відновлення, з попередніх досліджень секвенування на тваринах AL того самого штаму делеції дуже рідко поширюються на область кодування гена GFP 19. Отже, спостережувані зміни ефективності NHEJ не можна пояснити зміною вірності NHEJ.

Попередні дослідження показали, що CR запобігає віковому зниженню здатності до відновлення 17,18, тоді як тут ми показуємо, що короткочасний CR посилює NHEJ у молодих тварин. Цей короткочасний КР, або, можливо, періодичне голодування може забезпечити додаткову користь. Екологічний стрес, наданий CR, може спричинити горметичну реакцію шляхом активації стресово-реакційних шляхів, таких як SIRT6, та механізмів регулювання ДНК, що регулюють. Поліпшення ефективності NHEJ призведе до зниження рівня стійкого пошкодження ДНК, зменшення загибелі клітин, поліпшення стабільності геному та зменшення мутаційного навантаження. Ця покращена стабільність геному, швидше за все, сприятиме зниженню захворюваності на рак та збільшенню тривалості життя, передбаченого CR. Наш висновок про те, що навіть короткочасного КР достатньо для спрацьовування цих сприятливих ефектів, важливий для практичного застосування ХР у людей, де довготривалого КР важко досягти, тоді як короткочасний КР або періодичне голодування є більш можливим.

Методи

Тварини

Всі експерименти на мишах проводились відповідно до рекомендацій, встановлених Комітетом тваринних ресурсів Рочестерського університету. У цьому дослідженні використовувались миші-самці, і всі вони були поодинокими для проведення експериментів з контролем калорій. Експерименти проводили на 3–5-місячних мишах C57BL/6, що містять касету-репортер NHEJ у локусі ROSA26, створеному Vaidya та співавт. 19 .