Локалізація, ідентифікація та висічення жирових складів миші
Адріен Манн
1 Кафедра екстреної медицини Медичного коледжу Університету Цинциннаті
Еллі Томпсон
1 Кафедра екстреної медицини Медичного коледжу Університету Цинциннаті
Натан Роббінс
1 Кафедра екстреної медицини Медичного коледжу Університету Цинциннаті
Андра Л. Бломкалнс
1 Кафедра екстреної медицини Медичного коледжу Університету Цинциннаті
Анотація
Вступ
Адіпозе помітно з’явився в центрі уваги ЗМІ через різке збільшення ожиріння протягом останніх кількох десятиліть 20 століття. В даний час ожирінням страждає більше третини дорослих та 17% дітей та підлітків у Сполучених Штатах (США) 1. Охоплюючи всі етнічні групи, статистичні дослідження, що стосуються епідемії ожиріння, показали, що неіспаномовні чорношкірі мають найвищий коефіцієнт ожиріння з урахуванням віку (49,5%) порівняно з американцями Мексики (40,4%), усіма іспаномовними (39,1%) Латиноамериканські білі (34,3%) 2. Економічний ефект ожиріння також зростає занепокоєнням системи охорони здоров’я. У 2012 році було підраховано, що річна вартість медичних послуг на лікування ожиріння в США у 2005 році становила 190,2 мільярда доларів, що становить майже 21% від загального бюджету на медичні витрати. На жаль, за оцінками, ожиріння серед дітей лише на прямі медичні витрати призвело 14 мільярдів доларів. Статистично було встановлено, що середні медичні витрати на людей із ожирінням були на 2741 долар США на рік вищими, ніж у тих, хто не страждає на це 3-5 .
Ожиріння є основним фактором ризику для різних станів, таких як: діабет 2 типу, дисліпідемія, серцево-судинні захворювання, рак, розлади м'язового скелета та хронічне запалення. Ожиріння глибоко пов'язане з патогенезом метаболічного синдрому та інших хронічних захворювань 6-8. Маючи такі різкі та негативні зв’язки між ожирінням та іншими супутніми захворюваннями, наукові дослідження зосередили увагу на тому, щоб краще зрозуміти сучасну епідемію та різноманітні та ключові ролі жирової.
Історично жирова тканина вважалася незначною і розглядалася просто як проста тканина для заповнення. В даний час показано, що жирова кислота відіграє багато важливих ролей у функціонуванні організму: обмін речовин, регуляція гормонів, запалення, захист та ізоляція 9. Жирова тканина складається переважно з адипоцитів, але також містить перицити, ендотеліальні клітини, моноцити, макрофаги та плюрипотентні стовбурові клітини 8. Жирова тканина розподіляється по всьому тілу у різних депо. Основні депо можна знайти підшкірно, підшкірно, внутрішньом’язово та вісцерально 10. Показано, що жирові депо мають специфічні для депо метаболічні профілі, які демонструють специфічну схильність депо до ожиріння та пов'язаних з цим розладів 8 .
Традиційно жирова тканина класифікується на два основних типи: білу жирову тканину (WAT) і коричневу жирову тканину (BAT); хоча недавня література вказує на присутність третьої групи охрещеного брита або бежевого жиру 11. Показано, що жирова тканина має різні кольори, морфологію, метаболічні функції, біохімічні особливості та генетичні закономірності вираження 10. Адипоцити у ВАТ мають одну велику краплю ліпідів і мітохондрії в різній кількості. ВАТ переважно міститься в підшкірних та вісцеральних ділянках тіла. ВАТ функціонує насамперед як місце зберігання енергії та захисту органів. Адипоцити в БАТ мають мультилокулярну морфологію та рясні мітохондрії. BAT знаходиться переважно в області шиї та великих кровоносних судин грудної клітки, а також лопаток 12. BAT головним чином функціонує в енерговитратах, що регулюють термогенез 7. Показано, що жирний або бежевий адипоз має аналогічну морфологію та експресію BAT, але було встановлено, що походить від білих адипоцитів 11 .
Метою цього протоколу є надати точний метод ідентифікації та ізоляції різних типів жирових депо з різних анатомічних місць.
Протокол
ПРИМІТКА: Усі процедури на тваринах проводились із схвалення Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC) Університету Цинциннаті та відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин від Національного інституту охорони здоров’я (публікація NIH No . 85-23, переглянутий 1996).
1. Евтаназію та стерилізацію миші
Помістіть мишу в коробочку, що містить надтерапевтичну дозу ізофлурану, і дайте вдихнути для ефекту. Після того, як миша буде евтаназована, вийміть з коробки.
Вивих шийки матки як другий засіб евтаназії.
Стерилізуйте зовнішню поверхню миші, очищаючи тварину 70% етанолом.
2. Виявлення та виділення трьох різних жирових депо
Ізоляція коричневої жирової тканини (НДТ):
Переконайтеся, що хутро мокрий від очищення спиртом, щоб допомогти прорізати епідермальний та шкірний шари.
Розташуйте мишу в положенні лежачи спиною до столу.
Візьміть щипцями шкіру трохи нижче діафрагми, підніміть і розріжте ножицями.
Розріжте поперек по колу миші, щоб оголити очеревину.
Розкрийте депо BAT у формі метелика, знекровивши верхню половину миші. Тримайте нижні придатки та живіт однією рукою, підтягуючи шкіру вгору до голови.
Орієнтуйте мишу так, щоб вона розташовувалася на столі лежачи. Будьте обережні, щоб не забруднити відкрите депо волоссям.
Очистіть хірургічні інструменти та змініть нову пару рукавичок.
Знайдіть лопатки та відповідне депо. Акуратно видаліть будь-яку поверхневу білу жирову тканину зверху метелика, а потім розсічіть метелика з міжлопаткового коричневого жиру. Будьте обережні, щоб уникати м’язів, тісно пов’язаних з коричневим жиром. ПРИМІТКА. Для видалення білого жиру, а також для відділення коричневого жиру від лопаток рекомендується використовувати дисекційний мікроскоп.
Видаліть жировий склад і перенесіть його в мікропробірну пробірку об’ємом 2 мл.
Якщо потрібно виділити РНК або білок, заморозьте тканину зануренням у рідкий азот і зберігайте при -80 ° C. Відразу заморозьте зразок, щоб запобігти деградації. При культивуванні покрийте тканину ДМЕФ-12 і поставте на лід, поки не будуть зібрані всі зразки для культури (додаткова інформація).
Виділення підшкірної жирової тканини (SQ), депо білої жирової тканини (WAT):
Одягніть свіжу пару рукавичок, щоб не перехресне забруднення між жировими депо.
Розкрийте пахові трикутні депо SQ, знявши рукавички з нижньої половини миші. Тримайте однією рукою верхні придатки та грудну клітку, а другою рукою тягніть шкіру до стоп.
Орієнтуйте мишу в лежачому положенні, дотримуючись обережності, щоб не забруднити відкрите депо волоссям.
Очистіть хірургічні інструменти та змініть нову пару рукавичок.
Обережно розсічіть трикутники жиру SQ. Будьте обережні, щоб не забруднити зразок м’язами, сусіднім жиром, молочними залозами або вирізавши будь-які судини та не забруднити зразок кров’ю. ПРИМІТКА. Рекомендується використовувати дисекційний мікроскоп, якщо межі чітко не визначені.
Видаліть жирові депо та перекладіть у пробірки для мікроцентрифуги об’ємом 2 мл.
Якщо потрібно виділити РНК або білок, заморозьте тканину зануренням у рідкий азот і зберігайте при -80 ° C. Заморожте зразок відразу, щоб запобігти деградації.
Для фарбування зафіксуйте або вставте в OCT. При культивуванні покрийте тканину DMEF-12 і поставте на лід, поки не будуть зібрані всі зразки для культури (додаткова інформація).
Виділення жиру статевих залоз з вісцеральної жирової тканини (ПДВ) та депо білої жирової тканини (WAT):