Метаболічні наслідки цистинурії BMC Нефрологія Повний текст
Анотація
Передумови
Цистинурія - це спадковий розлад ниркового транспорту амінокислот, який викликає рецидивуючий нефролітіаз та значну захворюваність у людей. Частота захворювання становить 1 на 7000 у всьому світі, що робить його одним з найпоширеніших генетичних розладів у людини. Ми фенотипово охарактеризували модель миші цистинурії типу А, яка є результатом нокауту Slc3a1.
Методи
Нокаут Slc3a1 на рівні РНК і білка оцінювали за допомогою кількісної ПЛР в режимі реального часу та імунофлюоресценції. Slc3a1 нокаутованих мишей розміщували на звичайних дієтах або дієтах для селекціонерів і оцінювали на предмет утворення цистинових каменів з часом за допомогою рентгенологічного аналізу та розвитку пошкодження нирок шляхом вимірювання біомаркерів пошкодження. Пошкодження нирок також оцінювали за допомогою гістологічного аналізу. Рівні амінокислот вимірювали в крові мишей за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Рівні глутатіону в печінці вимірювали за допомогою люмінесцентного аналізу.
Результати
Ми підтвердили нокаут Slc3a1 на рівні РНК, тоді як Slc7a9 РНК, що представляє співтранспортер, була збережена. Як і слід було очікувати, ми спостерігали утворення каменів на сечовому міхурі в Росії Slc3a1 -/- миші. Самець Slc3a1 -/- миші демонстрували меншу вагу порівняно з Slc3a1 +/+ . Slc3a1 -/- миші на регулярній дієті продемонстрували підвищений вміст азоту сечовини в крові (BUN) без підвищення рівня креатиніну в сироватці крові. Однак розміщення тварин-нокаутів на дієті селекціонера, яка містить більш високу концентрацію цистину, призвело до розвитку підвищення BUN та креатиніну, що свідчить про більш важкі хронічні захворювання нирок. Гістологічне дослідження виявило, що ці дієтичні ефекти призвели до погіршення канальцевої обструкції нирок та запалення інтерстиціалу, а також погіршення запалення сечового міхура. Цистин є попередником для молекули антиоксиданта глутатіону, тому ми оцінили рівень глутатіону в печінці Slc3a1 -/- миші. Ми виявили значно знижений рівень як зниженого, так і загального глутатіону у нокаутуючих тварин.
Висновки
Наші результати свідчать про те, що дієта може впливати на розвиток та прогресування хронічної хвороби нирок на тваринній моделі цистинурії, що може мати важливе значення для пацієнтів із цією хворобою. Крім того, знижений рівень глутатіону може схилити людей з цистинурією до травм, спричинених окислювальним стресом.
Передумови
Створено мишачі моделі цистинурії I типу. Петерс та ін. виявив помилкову мутацію в Slc3a1 на екрані мутагенезу N-етил-N-нітрозосечовини (ENU) у мишей C3HeB/FeJ [8]. Автори продемонстрували знижену вагу нирок у гомозиготних чоловіків порівняно з самцями дикого типу та гомозиготними самками. Крім того, рівень плазмової сечовини в плазмі крові був підвищений у гомозиготних чоловіків віком від 13 до 20 тижнів порівняно з тваринами дикого типу. Ліврозет та ін. виявили спонтанну мутацію в Slc3a1 у 129 мишей SvPasCrl, що призводить до цистинурії [9]. Ниркова функція не була суттєво порушена у мишей-мутантів, як вимірювали за допомогою вимірювання рівня креатиніну в сироватці крові. Однак вони спостерігали збільшення макрофагів та інтерстиціальний фіброз у мутантних мишей. Ерколані та ін. продемонстрували перешкоду на виході із сечового міхура у самців мишей цистинурії на змішаному фоні C57Bl/6 та 129/SvJ [10]. Повідомляється про генетичну стратегію генерації цієї лінії миші цистинурії [11]; однак ми прагнули більш повно характеризувати цей штам миші цистинурії.
Методи
Тварини
Slc3a1 -/- та мишей дикого типу (самців та самок) виводили та утримували, як було описано раніше та відповідно до Інституційного комітету з догляду та використання тварин системи охорони здоров’я долини Нешвілла в Теннессі та Медичного центру університету Вандербільта [10, 11]. Звичайні та дієтичні дієти чау були отримані від Lab Diet (Сент-Луїс, Міссурі) з 5L0D, що відповідає нормальному, і 5LJ5 для заводчика. Мишей поселяли у системі охорони здоров’я долини Нешвілла в штаті Теннессі. Вимірювання ваги та довжини проводили на мишах, яких вирощували та утримували на чау-селекціонерах. Для вимірювання довжини мишей знеболювали ізофлураном і вимірювали від кінчика носа до кінчика хвоста. Тварин випадковим чином розподіляли до експериментальних груп. На завершення дослідження тварини були евтаназовані відповідно до Американської ветеринарної медичної асоціації газом СО2 з подальшим вивихом шийки матки.
ПЛР у реальному часі
Тканини миші видаляли і занурювали в РНК-пізніше (Qiagen, Valancia, CA) для досліджень експресії мРНК. РНК екстрагували за допомогою набору Qiagen RNeasy. Пари праймерів були розроблені з використанням програмного забезпечення Primer Express (Applied Biosystems, Фостер Сіті, Каліфорнія), а експресія GAPDH була використана як ендогенний контроль. Рівні експресії мРНК Slc3a1 і Slc7a9 були оцінені за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі з використанням SYBR green та ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Грунтовки наведені в таблиці 1.
Вестерн-блот, імунозабарвлення та гістологія
З цілих клітин готували білкові екстракти
Рентгенівська візуалізація
На зображенні зображено чотирнадцятитижневого чоловіка Slc3a1 -/- миші. Для моніторингу утворення каменів з часом мишей доставляли в Інститут зображень Вандербільта, знеболювали ізофлоураном та киснем до нерухомості, а потім поміщали в рентгенівський апарат Faxitron 2000 при встановленні 35 на час експозиції 4 с.
Вимірювання біомаркерів та амінокислот
Для вимірювання BUN та креатиніну кров збирали в пробірку мікроветви CB 300 Z з активатором згустків (Сарстедт, Ньютон, штат Північна Кароліна) шляхом піднижньощелепного кровотечі під анестезією ізофлураном 5,5 мм ланцетом. Зразки згортали при кімнатній температурі протягом> 30 хв і центрифугували при 4500 об/хв протягом 10-20 хв. Сироватку негайно розподіляли і зберігали при - 80 ° C для вимірювання азоту сечовини в крові Лабораторією порівняльної патології медичного центру Університету Вандербільта та вимірювання креатиніну лабораторією Core C Biomarkers University of Alabama-Birmingham O'Brien Center лабораторією LC-MS /РС. Концентрації амінокислот у плазмі крові визначали за допомогою ВЕРХ із зворотною фазою із застосуванням модифікованої версії методів Bidlingmeyer та співавт. [23].
Вимірювання глутатіону
Рівні глутатіону вимірювали за допомогою аналізу глутатіону GSH-GLO (Promega, Madison, WI) відповідно до інструкцій виробника. Концентрацію білка в печінкових лізатах визначали за допомогою BCA і концентрації нормалізували до 400 нг/мкл. Лізати печінки аналізували +/− 500 мкМ TCEP. TCEP зменшує будь-який окислений глутатіон, присутній у зразку. Люмінесценцію вимірювали за допомогою мікропланшету FLUOStar-Omega.
Результати
Ми вперше підтвердили нокаут Slc3a1 використання RT-PCR для оцінки рівня експресії в різних тканинах. Як і очікувалося, Slc3a1 Рівні РНК різко знижувались у тканинах, де зазвичай відбувається експресія, таких як нирки та тонкий кишечник (рис. 1а). Додатково, як очікувалося, Slc7a9 Рівень РНК був незмінним шляхом нокауту Slc3a1 (Рис. 1b). Далі ми використовували вестерн-блот та імунофлуоресцентну мікроскопію для оцінки втрати експресії rBAT у нирках Slc3a1 -/- миші. Вестерн-блот демонструє втрату експресії rBAT з лізатів нирок (рис. 1в). Імунофлуоресцентна мікроскопія для rBAT продемонструвала, що нокаут Slc3a1 призвело до втрати експресії rBAT в проксимальних канальцях Slc3a1 -/- мишей у порівнянні з мишами дикого типу (рис. 1d та e).