Метаболізм ліпідів скелетних м’язів при ожирінні Американський журнал фізіології та ендокринології

Кафедри фізіології,

Фізичні вправи та наука про спорт, лабораторія продуктивності людини,

Кафедри фізіології,

Фізичні вправи та наука про спорт, лабораторія продуктивності людини,

Анатомія і клітинна біологія, і

Хірургія, Медична школа Броді, Університет Східної Кароліни, Грінвілл, Північна Кароліна 27858; і

Кафедра внутрішньої медицини, Медичний факультет Єльського університету, Нью-Хейвен, штат Коннектикут 06510

Кафедри фізіології,

Фізичні вправи та наука про спорт, Лабораторія продуктивності людини,

Анотація

поширеність надмірної ваги/ожиріння та резистентності до інсуліну постійно зростає і пов'язана з підвищеним ризиком розвитку неінсулінозалежного цукрового діабету (NIDDM), гіпертонії та серцево-судинних захворювань (5, 11, 24). Клітинні механізми, що відповідають за інсулінорезистентність при надмірній вазі та ожирінні, поки не ясні. Дані показали, що внутрішньоміоклітинні триацилгліцерини (IMTG) збільшуються при ожирінні та NIDDM (14, 19, 21). Крім того, накопичення IMTG пов'язане з резистентністю до інсуліну скелетних м'язів (3, 13, 15,19, 23, 28, 29, 31, 36, 39). Однак вважається, що накопичення IMTG є не безпосередньою причиною розвитку резистентності до інсуліну, а що IMTG є інертним маркером присутності інших проміжних продуктів ліпідів (діацилгліцерину, жирних ацил-КоА, кераміду тощо)., які безпосередньо пов’язані з дефектами інсулінової сигналізації (8, 17, 25, 32, 37).

Суб'єкти людини

Двадцять чотири жінки брали участь у цьому дослідженні, яке складалося з восьми нормальної ваги [вік 45,1 ± 3,1 року; індекс маси тіла (ІМТ) 23,8 ± 0,58 кг/м 2], вісім із надмірною вагою/ожирінням (вік 44,0 ± 2,8 року; ІМТ 30,2 ± 0,81 кг/м 2) та вісім надзвичайно ожирінням (вік 37,9 ± 3,3 року; ІМТ 53,8 ± 3,5 кг/м 2) пацієнти, які переносять операцію на черевній порожнині, переважно шунтування шлунка та тотальну гістеректомію живота. Учасники дослідження були класифіковані за відповідними групами на основі ІМТ та класифікацій надмірної ваги та ожиріння, встановлених Національним інститутом охорони здоров’я (26). Критеріями включення ІМТ для осіб із нормальною вагою, надмірною вагою/ожирінням та надзвичайним ожирінням були ≤24,9, 25,0–34,9 та ≥40 кг/м 2 відповідно. Експериментальний протокол був схвалений Комітетом з питань досліджень і досліджень людини в Університеті Східної Кароліни та отримав інформовану згоду від усіх пацієнтів. Жоден із випробовуваних не мав жодних захворювань і не приймав ліків, які, як відомо, змінюють вуглеводний або ліпідний обмін. Всі пацієнти підтримували постійну масу тіла протягом року, що передував операції. Після нічного голодування (12–18 год) розпочато загальну анестезію барбітуратом короткої дії та підтримували фентанілом та сумішшю оксиду азоту та кисню.

Інкубація м’язової смужки

Відразу після хірургічного видалення зразок м’яза прямого черевного преса помістили в герметичний контейнер з кисневим крижаним буфером Кребса-Хенселейта для транспортування до лабораторії. М’язові смужки інкубували у модифікованій системі інкубації, як описано раніше (7). Коротко, м’язові смужки вагою mg25 мг дратували із зразка біопсії і затискали в люцитових затискачах, щоб підтримувати постійну довжину та напругу м’язів у стані спокою протягом усього препарату. Відрізані м’язові смужки негайно поміщали в 3,0 мл розігрітого (30 ° C) буфера Кребса-Хенселейта, загазованого 95% O2-5% СО2 (pH = 7,4), що містив 4% бичачого сироваткового альбуміну (без жирних кислот, Sigma Chemical, Сент-Луїс, Міссурі), 5 мМ глюкози (Sigma Chemical) та 1 мМ пальмітат (Sigma Chemical). Пальмітинову кислоту розчиняли в етанолі і до інкубаційного буфера додавали невеликий об'єм (0,8% від загального об'єму буфера) для досягнення кінцевої бажаної концентрації пальмітату.

Після 30-хвилинного періоду попереднього інкубаційного періоду зразки м’язів інкубували протягом 1 години при 30 ° C у тому ж самому інкубаційному середовищі, яке було зазначено раніше, з додаванням 0,75 мкКі [1- 14 C] пальмітату (New England Nuclear, Бостон, Массачусетс) . Це дозволило контролювати екзогенне окиснення пальмітату та включення пальмітату в ендогенні ліпідні басейни. Намагаючись усунути забруднення аналізів ендогенних ліпідних басейнів, весь видимий позаклітинний ліпід ретельно дражнили з м'язових смужок.

Окислення та включення пальмітату в ліпіди м’язів

Окислення.

Загальне окислення пальмітату визначали шляхом вимірювання та підсумовування 14 утворення СО2 та 14 мічених С водорозчинних метаболітів. Вимірювання 14 C-водорозчинних метаболітів враховувало будь-яку мітку 14 C, яка не дала 14 CO2 через ізотопного обміну в циклі трикарбонової кислоти.

Газоподібний 14 СО2, що утворюється в результаті окислення [1- 14 С] пальмітату під час інкубації, вимірювали шляхом перенесення 1,0 мл інкубаційного середовища у 20-мл скляний сцинтиляційний флакон, що містить 1,0 мл 1 M H2SO4 і 0,5-мл мікроцентрифуги Fisher пробірка, що містить 400 мкл гідроксиду бензетонію. Вивільнений 14 СО2 захоплювали в гідроксиді бензетонію на 60 хв, а пробірку для мікроцентрифуги, що містить захоплений 14 СО2, поміщали у сцинтиляційний флакон і підраховували. 14 C-водорозчинних метаболітів вимірювали, відбираючи 0,5 мл водної фази екстракції ліпідів (пояснено вЕкстракція ліпідів у м’язах), який помістили у сцинтиляційний флакон і підрахували.

Вилучення ліпідів у м’язах.

Аналіз нафти Red-O

Завдяки схемі включення [14 C] пальмітату в IMTG та IMLC, був проведений додатковий експеримент для вивчення загальної IMLC (TLC) в локомотивному м’язі в окремому наборі жінок. Аналіз масляного червоного випромінювання (30) проводили на зразках біопсії vastus lateralis із нормальною вагою ( = 6, ІМТ 22,1 ± 0,8 кг/м 2), надмірна вага/ожиріння ( = 6, ІМТ 32,9 ± 0,8 кг/м 2) та надзвичайно ожиріння ( = 7, ІМТ 42,8 ± 0,9 кг/м 2) самки.

Зразки м’язів отримували шляхом біопсії м’яза просторового боку за допомогою голки Бергстрома та всмоктуючого шприца з суб’єктами під місцевою анестезією. Зразки біопсії фракціонували і готували до мікроскопії в яскравому полі та аналізів Red Red-O. Коротко, зразки м’язів фіксували в 10% забуферованому формаліні протягом 24 годин з наступною 24-годинною інкубацією в 30% сахарозі. Зразки монтували в суміш оптимальної температури різання (OCT) · суміш гумки трагаканта і заморожували в ізопентані, охолоджуваному над рідиною N2. Зразки м’язів розділяли на поздовжні зрізи 10 мкм і поміщали в 60% -ний розчин ізопропілового спирту на 1 с з наступною 1-годинною інкубацією в масляній плямі Red-O. Потім зразки короткочасно (1–3 с) промивали 60% -ним ізопропіловим спиртом і промивали протягом 3 хв під проточною водопровідною водою. Протизабарвлення гематоксиліну Гарріса проводили протягом 5 хв, після чого проводили 3-хвилинне промивання під струменем водопровідної води, 3-хвилинне промивання хлоридом літію та додаткове 5-хвилинне промивання водопровідною водою.