Метилювання ДНК, пов’язане з ожирінням, на імпринтованих генах в спермі людини Результати дослідження TIEGER
Анотація
Передумови
Епігенетичне перепрограмування в гаметах ссавців скидає знаки метилювання, які регулюють моноалельну експресію імпринтованих генів. У чоловіків це включає стирання знаків метилювання матері та встановлення специфічного для батьків метилювання для належного керування нормальним розвитком. Ступінь впливу екзогенних факторів на вірність перепрограмування метилювання невідома. Раніше ми виявили взаємозв'язок між ожирінням батьків та зміненим метилюванням ДНК у пуповинній крові, припускаючи, що ендокринний, харчовий статус або спосіб життя батька можуть посилити епігенетичні відхилення від поколінь. Під час цих аналізів ми досліджуємо взаємозв'язок між надмірною вагою/ожирінням чоловіків та статусом метилювання ДНК відбитих генних регуляторних областей у гаметах.
Методи
Моделі лінійної регресії були використані для порівняння відсотків метилювання ДНК сперми, кількісно визначених за допомогою піросеквентування бісульфіту, у 12 диференційовано метильованих областях (DMR) у 23 чоловіків із надмірною вагою/ожирінням та 44 з нормальною вагою. Наше дослідження включало 69 добровольців із дослідження «Вплив навколишнього середовища на гаметичне епігенетичне перепрограмування» (TIEGER), яке базується в штаті Північна Кароліна, США.
Результати
Після коригування віку та стану пацієнтів із фертильністю, сперма чоловіків із надмірною вагою або ожирінням мала значно менший відсоток метилювання MEG3 (β = -1,99; SE = 0,84; стор = 0,02), NDN (β = -1,10; SE = 0,47; стор = 0,02), SNRPN (β = −0,65; SE = 0,27; стор = 0,02), і SGCE/PEG10 (β = -2,5; SE = 1,01; стор = 0,01) DMR. Наші дані також дозволяють припустити незначне збільшення метилювання ДНК у MEG3-IG DMR (β = +1,22; SE = 0,59; стор = 0,04) і H19 DMR (β = +1,37; SE = 0,62; стор = 0,03) у сперми чоловіків із надмірною вагою/ожирінням.
Висновки
Наші дані підтверджують, що статус надмірної ваги/ожиріння чоловіків простежується в епігеномі сперми. Потрібні подальші дослідження, щоб зрозуміти вплив таких змін та місце виникнення відмінностей метилювання ДНК між худими та чоловіками із зайвою вагою/ожирінням. Разом з нашими попередніми звітами про ожиріння батьків та епігенетичні зрушення у нащадків, наші дослідження створюють основу для майбутніх досліджень, що стосуються аберацій метилювання гаметичного самця у чоловіків через такі фактори способу життя батьків, як ожиріння.
Передумови
Сукупність досліджень, що підтверджують гіпотезу про те, що хронічні захворювання дорослих, такі як діабет ІІ типу, метаболічні розлади та ожиріння, походять з раннього віку, переросла у нову сферу розвитку здоров'я та хвороб (DOHaD) [1]. У світлі наростаючої епідемії ожиріння роль ожиріння батьків у впливі на розвиток потомства представляє особливий інтерес [2, 3]. Взаємозв'язок між материнським впливом на дієту та ожиріння та результатами потомства відзначався у багатьох дослідженнях [4–6], проте було порівняно менше досліджень щодо ролі батьків. Однак дедалі більший консенсус погоджується з тим, що не слід залишати без уваги вплив батьківських факторів, зокрема ожиріння, на здоров'я потомства [3, 7–9].
Наша попередня робота над когортою епігенетичного дослідження новонароджених (NEST) показала, що новонароджені діти з ожирінням мають модифікований епігеном у вигляді змінених профілів метилювання в деяких відбитих регіонах регуляції генів [24, 25]. Відбиті гени відрізняються від інших епігенетично регульованих генів тим, що їх епігенетичні знаки та схеми експресії залежать від батьківства походження, і ці моделі передаються з вірністю та послідовністю, що призводить до моноалельної експресії [26, 27]. Відбиткові знаки протистоять глобальному епігенетичному перепрограмуванню, яке відбувається після запліднення, до уточнення зародкового шару, фактично дозволяючи потомству успадковувати будь-які зміни цих стабільних знаків метилювання від батьків [7]. Таким чином, імпринтовані гени є ідеальними кандидатами для дослідження рано придбаних батьківських внесків у епігеноми потомства.
Для того, щоб остаточно пов’язати ожиріння батьків із модифікаціями метилювання потомства, такі зміни слід простежити до сперми батька. Дослідження сперматозоїдів дозволяє вивчити можливі зміни у встановленні епігенома чоловічої статевої клітини до будь-якого впливу та модуляції з боку материнських факторів та внутрішньоутробно навколишнє середовище. Дослідження на тваринах вже почали пов'язувати епігенетичні та фенотипові аномалії потомства з відповідними епігенетичними змінами сперми батьків. Вей та ін. встановили, що миші-самці з індукованою резистентністю до інсуліну та порушеною глюкозою натще мали потомство з підвищеною сприйнятливістю до діабету та зміненими схемами метилювання на своїх острівцях підшлункової залози, що відповідало зміненому метилюванню у спермі від їхніх батьків [20].
У людських популяціях проведено дуже мало досліджень, пов’язуючих ожиріння батьків із конкретними епігенетичними модифікаціями сперми. Метою цього дослідження було визначити, чи існує взаємозв'язок між надмірною вагою/статусом ожиріння та профілями метилювання в спермі в 12 відбитих регіонах. Наші гени, що представляють інтерес, включають експресований материнами ген 3 (MEG3), по батькові експресований ген 1/специфічна транскрипція мезодерми (PEG1/МОНТ), інсуліноподібний фактор росту 2 (IGF2), H19, фактор росту, пов'язаний з рецептором білок 10 (GRB10), нейронатин (NNAT), некдін (NDN), малий ядерний рибонуклеопротеїновий поліпептид N (SNRPN), епсилон саркоглікан (SGCE)/по батьковій експресії ген 10 (PEG10), генетично експресований ген 3 (PEG3), і геноподібний геном плейоморфної аденоми 1 (ПЛАГАЛ1). Ці відбиті гени є ефекторами росту, важливими для раннього росту ембріона та плода та/або регуляції росту пухлини.
Методи
Учасники дослідження та збір даних
Збір зразків
Волонтерів попросили здати сперму, сечу та зразки крові. Їх попросили утриматися від еякуляції щонайменше 3 дні, але не більше ніж за 10 днів до візиту. Насіння збирали на місці шляхом мастурбації без використання мастильних матеріалів у стерильний контейнер для збору поліпропілену (Cardinal Health, Дублін, Огайо). Посібник лабораторії Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ) для обстеження та обробки сперми людини 5-е видання було посиланням на нормальні значення [28]. Сперму аналізували на стандартні клінічні показники після зрідження, не пізніше 60 хв від забору. Після завершення цих клінічних аналізів сперми зразки піддавали двоступеневому центрифугуванню із градієнтом ISolate (Irvine Scientific) для відбору рухомої популяції, збагаченої нормальною морфологією. Цей колоїдний градієнт діоксиду кремнію, що складається з 90% нижнього шару та 50% верхнього шару, готується шляхом послідовного додавання 1,5 мл кожного в 15 мл полістирольної конічної трубки. Зразок сперми піпетували поверх верхнього шару і центрифугували при 200 ×g протягом 15 хв. Градієнтний розчин видаляли і гранульовану сперму заморожували та зберігали при -80 ° C для подальшого аналізу метилювання ДНК.
Аналіз метилювання ДНК
Були досліджені диференційно метильовані ділянки (DMR), пов'язані з наступними генами: Два DMR, проаналізовані на DLK1/MEG3 імпринт-домен складався з домену MEG3-IG DMR (4 сайти CpG) та MEG3 DMR (8 сайтів CpG) (chr 14q32.2). Регіон вище за течією IGF2 відбиті генні промотори включали три CpG-динуклеотиди (chr 11p15.5). DMR для H19 включав чотири сайти CpG (chr 11p15.5). Також були протестовані наступні DMR генних промоторів: GRB10 (6 сайтів CpG) (chr 7p12.2), NDN (6 сайтів CpG) (chr 15q11.2), NNAT (3 сайти CpG) (chr 20q.11.2), ПЛАГАЛ1 (6 сайтів CpG) (chr 6q24), SGCE/PEG10 (6 сайтів CpG) (chr 7q21.3), SNRPN (4 сайти CpG) (chr 15q11.2), PEG1/MEST (4 сайти CpG) (chr 7q21.3) та PEG3 (10 сайтів CpG) (chr 19q13.43) [29, 30].