Мезентеріальний жировий ліполіз опосередковує пов’язаний із ожирінням стеатоз печінки та резистентність до інсуліну

Анотація

Дослідження глюкозних затискачів

Дослідження глюкозних затискачів проводили, як описано раніше (23). Затискачі проводили у мишей, що вільно рухалися. ГІР розраховували, як тільки інфузія глюкози досягла більш-менш постійної швидкості з рівнем глюкози в крові 5 ммоль/л (80–90 хв після початку інфузії інсуліну). Після цього рівень глюкози в крові підтримували постійним на рівні 5 ммоль/л протягом 15–20 хв і розраховували ГІР. Швидкість утилізації глюкози розраховували шляхом ділення швидкості вливання [3- 3 H] глюкози на плазмову [3- 3 H] глюкозо-специфічну активність (24,25). Ендогенне вироблення глюкози (EGP) під час затиску обчислювали шляхом віднімання ГІР із швидкості утилізації глюкози (24,25). Для оцінки тканин-специфічного поглинання глюкози через катетер в кінці періоду стійкого стану вводили болюс (10 мкКі) 2- [1- 14 С] дезоксиглюкози. Кров відбирали через 2, 15, 25 та 35 хв після болюсної доставки. Площа під кривою зникаючої плазми 2- [1- 14 C] дезоксиглюкози використовувалась разом з тканинною концентрацією фосфорильованої 2- [1- 14 C] дезоксиглюкози для розрахунку поглинання глюкози.

ліполіз

Аналізи ліполізу

Виділили адипоцити та оцінили ліполіз, як описано раніше (26). Ізольовані адипоцити інкубували за відсутності або присутності 100 нмоль/л інсуліну, 100 нг/мл рекомбінантного мишачого IL-6 (R&D Systems) або 1 мкмоль/л ізопротеренолу (Sigma, Buchs, Switzerland) протягом 1 години. Рівні FFA вимірювали методом ACS-ACOD-MEHA (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Німеччина).

Визначення розміру клітини

Розмір клітин ізольованих адипоцитів аналізували за допомогою Multisizer 3 Coulter Counter, як описано раніше (27).

Забір крові

Черевна порожнина миші була відкрита відразу після вбивства і оголена ворітна вена. Ворітну вену проколювали шприцом (0,30 мм [30G] × 8 мм; BD, Franklin Lakes, NJ) і збирали кров. Системну кров відбирали після пункції серця за допомогою подібних шприців. Кров додавали в пробірку Еппендорфа з кінцевою концентрацією 5 ммоль/л ЕДТА. Після центрифугування плазму зберігали при -80 ° C до подальшої обробки.

Визначення рівнів плазмового інсуліну, тригліцеридів та FFA

Рівні тригліцеридів у плазмі крові (TG) та FFA визначали, як описано в інших роботах (28). Рівні інсуліну в плазмі крові вимірювали за допомогою набору ELISA, як описано раніше (29).

Вестерн-блотинг

Зразки печінки або АТ гомогенізували та проводили вестерн-блот, як описано раніше (30). Були використані наступні первинні антитіла: анти-gp130 та антисупресор сигналізації цитокінів 3 (SOCS3) (Санта Круз Біотехнологія, Даллас, Техас); anti-phosphop38, anti-phosphoERK та anti-ERK (Cell Signaling, Danvers, MA); та протиактинові (Millipore, Billerica, MA). Мембрани аналізували за допомогою люмінесцентного аналізатора зображень з програмним забезпеченням Image Reader (FujiFilm, Дільсдорф, Швейцарія).

Екстракція РНК та кількісна RT-PCR

Загальну РНК екстрагували за допомогою міні-набору RNeasy Lipid Tissue Mini (QIAGEN, Базель, Швейцарія), і концентрацію визначали спектрофотометрично (NanoDrop 1000; NanoDrop Instruments, Бостон, Массачусетс). Одну мікрограму РНК транскрибували за допомогою зворотної транскриптази SuperScript III (Invitrogen, Базель, Швейцарія), використовуючи випадковий праймер гексамеру (Invitrogen). TaqMan (Applied Biosystems, Роткройц, Швейцарія) використовували для ампліфікації ПЛР у режимі реального часу. Були використані наступні ПЛР-праймери (Applied Biosystems): фактор некрозу пухлини-α (TNF-α), Mm00443258_m1; Іл-6, Mm00446190_m1; F4/80, Mm00802529_m1; CD11b, Mm00434455_m1; синтаза жирних кислот (FAS), Mm00662319_m1; рецептор-α, що активується проліфератором пероксисоми (PPARα), Mm00627559_m1; SREBP1, Mm00550338_m1; SCD-1, Mm01197142_m1; CPT-1, Mm00550438_m1; та AOX, Mm00443579_m1. Відносну експресію гена отримували після нормалізації до 18S РНК (Applied Biosystems) за допомогою рівняння 2 −ΔΔcp (31).

ТГ печінки та визначення загальних ліпідів

Тканину печінки (20–30 мг) гомогенізували в PBS, а ліпіди екстрагували в суміші хлороформ-метанол (2: 1). Загальні ліпіди печінки визначали за допомогою сульфо-фосфо-ванілінової реакції, як описано раніше (32). Рівні ТГ печінки визначали в 50 мг тканини печінки за методом Блай і Дайєра (33) та кількісно визначали ферментативним аналізом (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Швейцарія).

Гістологія

Тканини печінки фіксували у 4% забуференному формаліні та вкладали у парафін. Зрізи вирізали і фарбували гематоксилін-еозином.

Аналіз даних

Подібне збільшення ваги та адипогенез у мишей gp130 F/F та gp130 Δadipo. В: Вестерн-блот-аналіз рівнів білка gp130 у відповідних клітинах і тканинах мишей gp130 F/F та gp130 Δadipo. B: Маса тіла мишей, що годуються чау (●, ●) та HFD (■, ■) gp130 F/F та gp130 Δadipo (n = 5–24). Ваги жирових відкладень епідидимальних (C) та мезентеріальних (D) складів мишей gw130 F/F та gp130 Δadipo, що харчуються HFD та gp130 (n = 6–18). Діаметр епідидимальних (E) та мезентеріальних (F) адипоцитів мишей, що годуються чау (●, ●) та HFD (■, ■) gp130 F/F та gp130 Δadipo (n = 4–6). Дані є середніми ± SEM. * P Δadipo; Адіпо, адипоцити; F/F, gp130 F/F; SkM, скелетний м'яз.