MicroRNA-17-5p посилює пошкодження ліпополісахаридів в клітинах носового епітелію шляхом націлювання
Анотація
Передумови
У всьому світі риніт є одним з найпоширеніших хронічних розладів. Незважаючи на наявність ліків для лікування симптоматики риніту, дослідники все ще зосереджуються на визначенні нових молекулярних цілей для кращого лікування. МікроРНК беруть участь у багатьох біологічних та патологічних процесах. Однак роль miR-17-5p у риніті залишається невивченою. Це дослідження мало на меті дослідити роль miR-17-5p у пошкодженні клітин RPMI2650 носового епітелію, спричиненого ліпополісахаридами (LPS), та з'ясувати можливий основний молекулярний механізм.
Результати
LPS пошкоджував клітини RPMI2650, пригнічуючи проліферацію клітин, сприяючи апоптозу та стимулюючи вивільнення запальних цитокінів. Експресія miR-17-5p була значно збільшена в клітинах RPMI2650 після обробки LPS. Крім того, було встановлено, що надмірна експресія miR-17-5p призвела до загострення пошкодження, спричиненого LPS. miR-17-5p негативно регульована експресія Smad7; надмірна експресія Smad7 захищала клітини RPMI2650 шляхом інактивації шляхів NF-κB та Wnt/β-катеніну і навпаки.
Висновки
Надмірна експресія miR-17-5p погіршує LPS-індуковану шкоду клітин RPMI2650. Вираз Smad7 негативно регулювався miR-17-5p; Експресія Smad7 інактивована шляхами NF-κB та Wnt/β-катеніну.
Передумови
Риніт - одне з найпоширеніших запальних розладів верхніх дихальних шляхів [1]. Цей стан викликається впливом клітин слизової оболонки носа на алергени. Сучасна статистика свідчить, що приблизно 15% підлітків страждають на алергічний риніт у всьому світі [1, 2]. Окрім закладеності носа, відчуття свербежу та частого чхання, риніт також є однією з важливих причин порушеного сну [1]. Цей стан важко діагностується у маленьких дітей [3]. Визначення можливих факторів генетичної та екологічної мутагенності, з’ясування молекулярних шляхів, пов’язаних із патогенезом риніту, визначення нових цільових препаратів та вдосконалення сучасних стратегій лікування, залишаються основною метою досліджень риніту [1,2,3].
МікроРНК (miRNAs або miRs) належать до сімейства некодуючих РНК, як випливає з їх назви, вони менших розмірів і складаються з 22-25 нуклеотидів. miРНК зв’язуються з 3’-UTR (неперекладеною областю) відповідної мРНК і спричиняють посттрансляційне інгібування цих мРНК [4]. Відомо, що мікроРНК широко експресуються в людському організмі, і вони модулюють різноманітні фізіологічні та патологічні процеси, такі як розвиток органів, проліферація клітин, диференціація клітин, пухлини та апоптоз [5]. Дослідження вже встановили роль декількох miРНК у риніті, включаючи miR-21, miR-30-5p, miR-199b-3p, miR-874, miR-28-3p, miR-203, miR-875-5p тощо. . [6,7,8]. Деякі з вищезазначених мікроРНК мають високу експресію, а деякі - низьку експресію [6,7,8].
Кілька досліджень досліджували роль miR-17-5p у різних видах раку [9,10,11,12]. Наприклад, miR-17-5p опосередковує індуковану гіпоксією аутофагію та інгібує апоптоз у клітинах гладких м’язів судин [13]. Підвищена експресія miR-17-5p індукувала проліферацію та інгібувала апоптоз клітин раку легенів, водночас знижуючи чутливість клітин раку легенів до гефітинібу [14]. Крім того, miR-17-5p розглядали як потенційну терапевтичну мішень для атеросклеротичних уражень [15], запалення сітківки [16], нетравматичного остеонекрозу головки стегнової кістки [17] та жирової печінки [18]. Однак жодне дослідження не проводилось для вивчення ролі miR-17-5p у риніті.
Ліпополісахарид (LPS), агоніст рецептора 4, що називається платним, є основним компонентом клітинної стінки грамнегативних бактерій. Її основною функцією є підтримка структурної цілісності бактеріальної клітини [19]. LPS також діє як ендотоксин, який виробляє сильну імунну відповідь та запалення [20]. Дослідження вже використовували LPS-індуковане пошкодження носових епітеліальних клітин як модель риніту [19]. У цьому дослідженні ми досліджували роль miR-17-5p у LPS-індукованому пошкодженні носових епітеліальних клітин, а також намагалися дослідити основні молекулярні шляхи та мішені.
Методи
Культура клітин та лікування
Клітинна лінія носових епітеліальних клітин людини (RPMI2650) була придбана у American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Клітини RPMI2650 регулярно культивували в RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US) з доповненням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS; Sigma, St. Louis, MO, USA) у присутності пеніциліну/стрептоміцину (Sigma, St. Louis, MO, США) при 37 ° C у зволоженій камері з 5% CO2. Клітини обробляли LPS (5 мкг/мл) протягом 12 годин.
трансфекція міРНК
Scramble, imNic siNC, si-miR-17-5p та miR-17-5p були синтезовані GenePharma Co (Шанхай, Китай). Трансфекцію клітин проводили з використанням реагенту Lipofectamine 3000 (Invitrogen) відповідно до протоколу виробника.
Кількісна ПЛР у реальному часі (RT-PCR)
РНК з культивованих клітин екстрагували за допомогою чистого набору для швидкої екстракції РНК (Bioteke Corporation, Пекін, Китай) відповідно до інструкцій виробника. Для зворотної транскрипції міРНК одностадійний синтез кДНК здійснювали додаванням полі (А) хвоста до 3 ′ кінця міРНК за допомогою праймера-адаптера оліго (dT) та зворотної транскриптази Super M-MLV (Bioteke Corporation, Пекін, Китай). Для мРНК загальні РНК були зворотно транскрибовані в реакційній системі, що містить випадкові праймери та зворотну транскриптазу M-MLV. Згодом продукти зворотної транскрипції (кДНК) ампліфікували за допомогою ланцюгової реакції полімерази в реальному часі (RT-PCR) із SYBR green Master Mix; RT-PCR проводили в кількісному тепловому блоці Exicycler 96 у реальному часі (BIONEER, Daejeon, Південна Корея). U6 використовували як внутрішній контроль для аналізу експресії міРНК, тоді як GAPDH використовували як внутрішній контроль для визначення рівнів експресії мРНК. Умови RT-PCR були такими: початкова інкубація 10 хв при 95 ° C, потім 40 циклів при 95 ° C протягом 10 с, при 60 ° C протягом 20 с і при 72 ° C протягом 30 с, після чого 5 хв. інкубація при 4 ° С. Відносний кількісний аналіз проводили за допомогою методу 2 - - △ КТ. Кожен зразок аналізували у трьох примірниках, і всі експерименти проводили тричі незалежно.
Трансфекція та генерація стабільно трансфікованих клітинних ліній
Повномірні послідовності Smad7 та РНК з короткими шпильками, спрямовані проти Smad7, були сконструйовані у плазмідах pEX-2 та U6/GFP/Neo (GenePharma) відповідно. Їх називали pEX- Smad7 та sh- Smad7, відповідно. Реагент ліпофектамін 3000 (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Каліфорнія, США) був використаний для трансфекції клітин відповідно до інструкцій виробника. Плазміду, несучу нецільову послідовність, використовували як негативний контроль (NC) sh-Smad7, званий sh-NC. Стабільно трансфіковані клітини відбирали за допомогою культурального середовища, що містить 0,5 мг/мл G418 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Приблизно через 4 тижні були встановлені стійкі до G418 клони клітин.
Аналіз CCK-8
Клітини висівали в 96-лунковий планшет з 5000 клітинами/лунку. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою комплекту для підрахунку клітин-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD). Коротко, після стимуляції, розчин CCK-8 додавали до культурального середовища, і культури інкубували протягом 1 години при 37 ° С у зволоженому 95% повітрі та 5% СО2. Поглинання вимірювали при 450 нм за допомогою зчитувача мікропланшетів (Bio-Rad, Hercules, CA).