MicroRNA-26a захищає від серцевої гіпертрофії шляхом інгібування GATA4 у моделі щурів та культивування

  • Журнал Головна
  • Поточне питання
  • Майбутній випуск
  • Найчитаніші
  • Найчастіше цитовані (розміри)
    • Останні два роки
    • Разом
  • Найчастіше цитовані (CrossRef)
    • Минулий рік 0
    • Разом
  • Соц.медіа
    • Минулий місяць
    • Минулий рік
    • Разом
  • Архів
  • Інформація
  • Онлайн подання
  • Інформація для авторів
  • Редагування мови
  • Інформація для рецензентів
  • Редакційна політика
  • Редакційна колегія
  • Цілі та сфера застосування
  • Абстрагування та індексування
  • Бібліографічна інформація
  • Інформація для бібліотекарів
  • Інформація для рекламодавців
  • Передруки та дозволи
  • Зверніться до редактора
  • Загальна інформація
  • Про Спандідос
  • Конференції
  • Вакансії
  • Зв'язок
  • Правила та умови
  • Автори:
    • Ян Лю
    • Чжицян Ван
    • Веньлян Сяо

  • Ця стаття згадується в:

    Анотація

    Всебічне дослідження виявило безліч мікроРНК, які аберативно виражаються в серцевій гіпертрофії, серед яких miR-26a виявляє велику експресію в нормальному серці (16). У зв’язку з цим було висунуто гіпотезу, що miR-26a може бути важливим регулятором гіпертрофії серця, і тому в цьому дослідженні проведено серію експериментів з поперечним звуженням аорти черевної порожнини (TAAC) та ангіотензином II (Ang II) індуковані кардіоміоцити (КМ), виділені із серця новонароджених щурів. Надмірне вираження та придушення miR-26a опосередковувалося його імітатором та інгібітором відповідно. Передсердний натрійуретичний фактор (ANF) та важкий ланцюг β-міозину (β-MHC) оцінювали як показники гіпертрофії серця. Крім того, дане дослідження мало на меті підтвердити, чи GATA4 є мішенню miR-26a шляхом мутації цільових сайтів у 3′-UTR GATA4. За допомогою цих експериментів дане дослідження мало на меті з’ясувати роль miR-26 та його регуляторний механізм в опосередкуванні серцевої гіпертрофії, що може забезпечити ліди для терапевтичних цілей при лікуванні серцевої гіпертрофії.

    інгібування

    Матеріали і методи

    Тварини
    Клітини
    Трансфекція клітин та аналіз репортерної функції подвійної люциферази

    Ціль-ген miR-26a прогнозували за допомогою TargetScan (www.targetscan.org). Мутант 3′-UTR GATA4 був синтезований за допомогою набору QuikChange Multi-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Дикий тип або мутант 3′-UTR GATA4 клонували в сайти рестрикції Kpn I та Bgl II нижче за течією відкритої рамки зчитування люніферази ренілли у векторі люциферази pGL3-промотору (Promega, Madison, WI, USA). СМ, культивовані в 24-лункових планшетах (1,5 × 10 5 на лунку), трансфікували імітатором miR-26a (50 нМ) або інгібітором (Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай) і котрансфікували репортером люциферази, що містить дикого типу або мутанта 3′-UTR GATA4 (200 нг) або репортерної люциферази репортерної плазміди pRL-RSV (20 нг; Promega) з використанням Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) згідно з протоколом виробника. Надмірна експресія GATA4 була досягнута шляхом трансфекції вектора T (200 нг; Promega), що містить кодуючу послідовність GATA4. Через 48 годин після трансфекції активність люциферази визначали за допомогою системи виявлення GloMax®-Multi (Promega), нормалізованої щодо активності гена люциферази Renilla.

    Імуногістохімія та імуноцитохімія

    Тканину серця щурів у групах Control та TAAC вкладали у парафін і розрізали на шматочки 4 мкм. Загалом 1 × 10 5 СМ висівали на предметне скло в 6-лункові планшети, культивували та обробляли Ang II, як описано вище. Клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 15 хв і транспарентизували 0,5% Triton X-100 протягом 20 хв. Всі предметні стекла тканин та клітин інкубували в 3% H 2 O 2 протягом 15 хв при кімнатній температурі. Клітини блокували інкубацією в козячій сироватці (Sigma-Aldrich China, Inc.) протягом 30 хв, а потім клітини інкубували з мишачим моноклональним анти-α-актиніновим антитілом (1: 1000; Abcam; кат. № ab108198 ) при 4 ° C протягом ночі, а потім кон’югованим вторинним антитілом, конусованим проти козиних пероксидаз хрону (HRP) (1: 2000; Abcam; кат. № ab7090), протягом 30 хв. Позитивні сигнали розроблялися з використанням фарбування діамінобензидином (Solarbio, Пекін, Китай), після чого клітини фарбували гематоксиліном. Слайди спостерігали під мікроскопом (MM200; Nikon, Токіо, Японія), а площа СМ розраховували за допомогою ImageJ версії 1.49 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

    Аналіз включення лейцину

    Аналіз включення лейцину проводили для відображення синтезу білка в СМ. Після обробки Ang II до клітин додавали 3 Н-мічений лейцин (1 мкКі/мл) для інкубації при 37 ° C протягом 12 годин. Згодом клітини тричі промивали холодним сольовим розчином, забуференним фосфатом, і лізували в буфері для лізису. Сигнал лейцину [3 H] виявляли шляхом рідинного сцинтиляційного підрахунку за допомогою Tri-Carb (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA).

    Кількісна ПЛР із зворотною транскрипцією (RT-qPCR)
    Вестерн-блот-аналіз

    СМ та тканини серця лізували в холодному буфері аналізу радіоімунопреципітації (RIPA) (Інститут біотехнології Бейотіме, Шанхай, Китай), а витягнуті зразки білків кількісно визначали за допомогою набору для аналізу білків Bio-Rad (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія, США ). Ідентичні кількості зразків білка відокремлювали за допомогою електрофорезу 10% додецилсульфату натрію та поліакриламідного гелю та переносили на мембрану з полівініліденфторидом (Roche). Мембрану блокували 5% знежиреного молока при кімнатній температурі протягом 2 годин, після чого проводили інкубацію із специфічним первинним антитілом проти GATA4 (1: 1000; Abcam; кат. № ab86371) при 4 ° C протягом ночі. GAPDH використовувався як внутрішнє посилання. Після триразового промивання протягом 5 хв кожного разу в забуференному трісом фізіологічному розчині з Твін (TBST) мембрану інкубували з кон'югованим HRP вторинним антитілом при кімнатній температурі протягом 2 годин і знову промивали в TBST. Згодом позитивні смуги були розроблені з використанням підсиленої хемілюмінесценції (ECL) Plus Western Blotting субстрат (Thermo Fisher Scientific, Inc.) та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення ImageJ 1.49.

    Статистичний аналіз

    Фігура 1

    miR-26a інгібує серцеву гіпертрофію на TAAC-індукованій моделі щурів. (A) Частка HW, позначена HW/BW, більша у групі TAAC. (B) Відносна площа СМ більше у групі TAAC. (C) Експресія мРНК ANF та β-MHC підвищена в групі TAAC. (D) Рівень miR-26a пригнічений у групі TAAC. * Р ANF та β-MHC-мРНК були суттєво підвищеними, при лікуванні Ang II (P 3 H] також вимірювали вміст лейцину для оцінки швидкості синтезу білка в СМ, оскільки прискорений синтез білка є ще однією характеристикою серцевої гіпертрофії. Ці результати продемонстрували що синтез білка був посилений у СМ, оброблених Ang II, хоча це посилення було зменшене надмірною експресією miR-26a.У сукупності ці результати показали, що CM, індуковані Ang II, виявляли серцеві гіпертрофічні властивості, такі як більша площа СМ, ​​прискорений синтез білка і сприяння експресії генів, пов'язаних з гіпертрофією серця. Однак надмірна експресія miR-26a змогла суттєво пригнічувати ці ефекти, маючи на увазі, що вона відіграє певну роль у пригніченні гіпертрофії серця в культивованих СМ.