Мікробіота кишечника та ожиріння
Кайл Дж. Вольф
кафедра мікробіології Університету Алабами в Бірмінгемі
Робін Г. Лоренц
кафедра мікробіології Університету Алабами в Бірмінгемі
b Кафедра патології в Університеті Алабами в Бірмінгемі
Анотація
Поточна епідемія ожиріння, безумовно, має багато причин, включаючи вплив нашого сучасного світу як на наше харчування, так і на наш спосіб життя/фізичну активність. Хоча було рекомендовано багато втручань, поширеність ожиріння продовжує зростати, що змусило переоцінити потенційні втручання, які можуть мати вплив. В останні роки було остаточно доведено, що мікробіоти в шлунково-кишковому тракті змінюються у людей із ожирінням. Останні дані дають потенційне механістичне розуміння взаємодії між мікробіотою та ожирінням і дозволяють пропонувати нові потенційні заходи щодо боротьби з ожирінням.
Вступ
В даний час в Сполучених Штатах спостерігається епідемія ожиріння, причому останнє дослідження свідчить про поширеність 32,2% серед дорослих чоловіків та 35,5% серед дорослих жінок [1]. Важливими факторами цієї епідемії є наш раціон, де все більше вуглеводів і жирів, та відсутність фізичної активності [2]. Незважаючи на те, що ці фактори є критичними, це явно не вся історія; у 2004 р. Бекхед та ін. [3] запропонував додатковий механізм, який впливав на мікробіоти шлунково-кишкового тракту (ШКТ).
Популяція мікробіоти, яка постійно перебуває, є важливою складовою розвитку та зрілості кишкового тракту та імунної системи хазяїна, і тому її почали розглядати деякі віртуальні органи, відомі як мікробіоми [4]. Мікробіом кишечника - це сукупність мікробів (бактерій, вірусів тощо), їх генетичних елементів (геномів) та взаємодії навколишнього середовища в межах ШКТ. Цей мікробіом містить у 10 разів більше організмів, ніж кількість клітин в організмі людини, але на відміну від інших органів його склад дещо нестабільний. Популяції бактерій, що проживають, можуть бути змінені протягом 24 годин після зміни дієти; тому отримання уніфікованої картини мікробіому може бути складним твердженням [5].
Залучення мікробіоти кишечника до епідемії ожиріння вперше було запропоновано тим фактом, що дорослі миші C57BL/6 без мікробів (тобто без бактерій) мали збільшення вмісту жиру в організмі на 60%, коли їх конвенціоналізували (тобто, колонізований) мікрофлорою сліпої кишки здорової нормальної миші C57BL/6 [3]. Механізм цього збільшення вмісту жиру в організмі передбачався, включаючи той факт, що мікробіота матиме здатність регулювати врожай енергії з харчових компонентів і, отже, змінювати накопичення енергії в хазяїні. З моменту первинної публікації в 2004 р. Зараз було опубліковано 138 публікацій про первинні дані та 60 оглядів, які PubMed знайшов за результатами пошуку ожиріння та мікробіоти. Ці публікації призвели до пропозиції трьох унікальних механізмів, за допомогою яких мікробіота може впливати на ожиріння господаря, і вони обговорюються в цьому огляді.
Експериментальні підходи до вивчення мікробіома
Дослідження мікробіома кишечника є унікальним серед систем органів, оскільки мікробіом може виливатися та поповнюватися, і є унікальна можливість вивчати цей “орган” протягом тривалих періодів часу, отримуючи зразки калу від однієї особини. Цей тип аналізу призвів до концепції "ентеротипів" мікробіому кишечника, і останні дані 22 осіб показали обмежену кількість симбіотичних станів хазяїн-мікроб, які можуть по-різному реагувати на дієти [6]. Однак дані зразків калу слід інтерпретувати з обережністю, оскільки кілька груп вказують на те, що спільноти мікробіоти калу відрізняються від асоційованих із слизовими оболонками бактерій у ШКТ [7, 8]. Оскільки методи вивчення, вимірювання та модифікації мікробіому є дещо унікальними для цієї галузі, а іноді не входять до звичайного репертуару навичок, які використовували б інші біологи, у цьому огляді ми докладно описали деякі експериментальні підходи.
Культура та ідентифікація бактерій
Бактеріальний посів та ідентифікація широко використовуються для ідентифікації патогенних або резидентних бактеріальних компонентів калу чи тканини [9]. Цей метод використовує давні фенотипові практики ідентифікації, такі як рухливість, форма, структура колонії та використання цукру/метаболіту. Однак багато видів залишаються невизначеними, оскільки в даний час не існує відомого методу культивування цих груп за межами кишкового тракту, і з цієї причини були розроблені більш досконалі методи з використанням ампліфікації нуклеотидів.
Флуоресценція In Situ Гібридизація
Флуоресценція in situ гібридизація (мікроскопія-FISH) історично використовувалась для ідентифікації бактерій, що присутні в зрізах тканин без очищення нуклеїнової кислоти. Коротко кажучи, радіоактивні або флуоресцентно-мічені зонди на основі нуклеїнової кислоти, націлені на 16S рибосомну РНК, використовуються для проникнення збережених гістологічних зразків і дозволяють візуалізувати конкретні організми [10]. Ця процедура має перевагу в точній локалізації бактерій, але не дає кількісних результатів. Новіший метод, що поєднує FISH з проточною цитометрією (FCM-FISH), більше не дозволяє локалізувати тканини, але в поєднанні з плямами ДНК є швидким, надійним та кількісним методом аналізу змішаних зразків бактерій у фекаліях [11].
Кількісна ланцюгова реакція полімерази в режимі реального часу
Кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (qRT-PCR) є другим методом підрахунку кількості бактерій, що присутні в калі (або зразках тканин), але вона залежить від вилучення нуклеїнової кислоти із зразків. qRT-ПЛР має дуже високу чутливість і відтворюваність і дуже швидко виконується [12]. Як і у випадку з FISH, специфічні мікроорганізми виявляються на основі зондів, специфічних для послідовностей, але кількісно можна визначити лише організми з відомими послідовностями.
Денатураційний градієнтний гель-електрофорез та 454 піросеквенування
Існує два методи на основі нуклеїнових кислот, які дозволяють ідентифікувати невідомі та некультурні організми. Денатуруючий градієнтний гель-електрофорез (DGGE) - це метод створення фізичної картини бактеріального різноманіття за допомогою двовимірного (2D) денатураційного гелю. ДНК посилюється та відокремлюється на 2D-гелі, де ампліфіковані продукти мігрують відповідно до вмісту G: C і візуалізуються як унікальні смуги на гелі [13]. Ідентифікувати бактерії можна за допомогою комбінації очищення ДНК від гелю та методів секвенування Сангера [14]. Хоча методи секвенування Сангера можуть бути використані для ідентифікації численних послідовностей бактерій у зразках ГІ, нова високопродуктивна піросеквенуюча технологія пропонує більш швидкий та економічно ефективний метод загального аналізу мікробіомів. 454 Піросеквенування - це метод, який відрізняється від традиційного секвенування тим, що не вимірює закінчення ланцюга, а натомість покладається на виявлення вивільнення пірофосфату при включенні нуклеотидів. Зараз цей метод поєднано з новим підходом штрих-кодування, що дозволяє одночасно проводити послідовність послідовності декількох окремих зразків [15, 16].
Метатранскриптомічний підхід та ядерний магнітний резонанс
Використання цих швидких та екстенсивних методів секвенування виявило величезну різноманітність мікробіоти ШКТ та її швидко мінливий характер [5, 17]. Тому останні дослідження поєднують ці методи з аналізом експресії бактеріального гена. Цей метатранскриптомічний підхід ідентифікував «основний мікробіом» у експресії гена, а не в організмі, що асоціюється із ожирінням [17, 18]. Другий спосіб розглянути функцію цього “основного мікробіома” - це метаболоміка. Ядерно-магнітний резонанс (ЯМР) може бути використаний для вимірювання дуже дрібних молекул, таких як окремі амінокислоти, вуглеводи та ліпіди/жирні кислоти. Використовуючи унікальні магнітні властивості кожної молекули, ЯМР вимірює магнітне випромінювання зразка і здатний виміряти сотні молекул. Це оптимально при спробі виміряти малі молекули як з сироватки, так і навіть з калу [19]. За допомогою цього типу техніки можна визначити мікробні метаболіти, що утворюються під час ферментації товстої кишки харчових продуктів, та визначити їх подальший вплив на метаболіти крові та тканин [20–22].