Мікрорідка краплинна платформа для надвисокої пропускної здатності одноклітинного скринінгу біорізноманіття PNAS

  • Знайдіть цього автора на Google Scholar
  • Знайдіть цього автора на PubMed
  • Шукайте цього автора на цьому сайті
  • Для листування: gabibov @ mx.ibch.rusidney.altman @ yale.edu

Внесені Сідні Альтманом, 7 січня 2017 р. (Надіслано на огляд 15 вересня 2016 р .; переглянуто Робертом С. Філліпсом та Ізраїлем Сільманом)

краплинна

Стаття Рисунки & SI

Цифри

Основна схема методики MDE – FACS. Розділення бібліотеки видів зі специфічними механізмами, що генерують флуоресценцію, в MDE з використанням емульгування в мікрофлюїдних чіпах дозволило одноклітинному зондуванню цільової функції. Лише певні фенотипи (позначені жовтою зіркою) підходять і активують механізм по краплях, що призводить до виробництва флуоресцентних речовин. Оскільки об'єм крапель був рівномірним, подібні концентрації та умови приводили до вузького розподілу флуоресценції, який відповідав тій самій активності. Флуоресцентний сигнал реєструвався звичайним сортувачем клітин, який відокремлював варіанти, що активували механізм (активатори), від тих, які цього не робили (сміття). Некультурні види аналізували шляхом прямої послідовності MDE. Якщо вибрані активатори можна було культивувати in vitro, їх регенерували з крапель, вирощували та аналізували за допомогою комбінації класичних методів (кінетика, LC-MS, секвенування та інші). W/O/W, подвійна емульсія вода в маслі у воді.

Скринінг біокаталізаторів, прикріплених до поверхні дріжджів, за допомогою MDE – FACS. (A) Розділення активних (RFP-позитивних) та неактивних (нефлуоресцентних) клітин дріжджів з флуорогенним субстратом. Після того, як суміш активних і неактивних клітин була капсульована, флуоресцентний продукт накопичувався виключно всередині крапель з активними клітинами, які були відібрані за допомогою FACS. (B) Візуалізація біохімічної реакції шляхом злиття сигналів зеленої флуоресценції (продукт реакції), червоної флуоресценції (білок-репортер) та зображення видимого світла. (Шкала шкали, 100 мкм.) (C) Ділянка відображає ефективність збагачення залежно від розведення активних клітин неактивними клітинами після одного раунду MDE – FACS. (D) Ефективність збагачення MDE – FACS для активних клітин, що відображають різні біокаталізатори (ДНКаза I, ЕК та BChE) та неактивні клітини (Fab), змішані у співвідношенні 1: 1: 1: 100. (E) Відбір мутантів BChE з різним рівнем активності з бібліотеки BChE до селекції (Lib) та після селекції за допомогою воріт G1 – G3. (Вставка) Накладання спектрів крапель MDE – FACS за допомогою Fab, бібліотеки BChE та WT BChE. Вказані ворота, що використовуються для сортування. Медіана ± інтерквартильні діапазони показані для кожної групи. P

Мікрофлюїдна інкапсуляція клітин у краплях MDE. (А) Послідовна емульгування в одноемульсійних чіпах. (B і C) Геометрія каналів мікрорідких мікросхем, що використовуються для виробництва MDE. (B) 20-мкм мікросхема, що використовується для інкапсуляції дріжджів. (C) 60-мкм мікросхема, що використовується для інкапсуляції бактерій та дріжджів. W/O, одинарна емульсія вода в маслі; W/O/W, подвійна емульсія вода в маслі у воді.