Набір інструментів для вивчення функцій цитозольної неспецифічної дипептидази 2 (CNDP2) з використанням дрозофіли як

Євгенія Н. Андрєєва

1 Інститут молекулярної та клітинної біології Сибірського відділення Російської академії наук, Новосибірськ, 630090 Росія

Ганна Олександрівна Огієнко

2 Новосибірський державний університет, Новосибірськ, 630090 Росія

Дубатолова Тетяна Д.

Анастасія Л. Ощепкова

3 Інститут хімічної біології та фундаментальної медицини Сибірського відділення Російської академії наук, Новосибірськ, 630090 Росія

Кожевникова Олена Миколаївна

Антон Васильович Іванкін

Павлова Гера Олександрівна

Сергій Олександрович Копил

Олексій Васильович Піндюрін

2 Новосибірський державний університет, Новосибірськ, 630090 Росія

Конференція

Пов’язані дані

Усі додаткові дані містяться в додаткових файлах. Матеріали, створені під час поточного дослідження, доступні у відповідних авторів за обґрунтованим запитом.

Анотація

Передумови

Експресія гена CNDP2 часто регулюється вгору або вниз при різних типах раку людини. Однак, як продукт цього гена бере участь у рості та розмноженні клітин, недостатньо вивчено. Більше того, наші знання про функції ортологів CNDP2 у добре відомих модельних організмів є дефіцитними. Зокрема, функція ортолога D. melanogaster CNDP2, кодованого геном CG17337 (далі - dCNDP2), досі невідома.

Результати

Це дослідження було спрямоване на розробку набору генетичних та молекулярних інструментів для вивчення ролі dCNDP2. Ми генерували нульову мутацію dCNDP2 (далі ∆dCNDP2), використовуючи CRISPR/Cas9-опосередковану гомологічну рекомбінацію (HR), і виявили, що мутанти CdCNDP2 є гомозиготними життєздатними, морфологічно нормальними та фертильними. Ми також генерували трансгенні мухолінії, що експресують білок dCNDP2 з міткою eGFP та без міток, все під контролем промотору UAS, а також поліклональні антитіла, специфічні для dCNDP2. Використовуючи ці інструменти, ми демонструємо, що лише одна з двох передбачених ізоформ dCNDP2 експресується в різних досліджуваних тканинах. dCNDP2 був виявлений як у цитоплазмі, так і в ядрі, і виявлено, що він пов'язаний з безліччю ділянок у політенових хромосомах слинної залози.

Висновки

Ген dCNDP2 не є важливим для життєздатності мух у стандартних лабораторних умовах. Характер субклітинної локалізації dCNDP2 свідчить про те, що цей білок може виконувати роль як у цитоплазмі, так і в ядрі. Генетичні та молекулярні інструменти, розроблені в цьому дослідженні, дозволять подальшу функціональну характеристику збереженого білка CNDP2 з використанням D. melanogaster як модельної системи.

Електронний додатковий матеріал

Інтернет-версія цієї статті (10.1186/s12863-019-0726-z) містить додаткові матеріали, доступні для авторизованих користувачів.

Передумови

Пептидази з різними субстратними особливостями відіграють неоднакову роль у метаболізмі білка та пептидів у еукаріотів. CNDP2 ссавців (також відомий як карнозиндипептидаза II, CN2, карбоксипептидаза глутамат-подібного, CPGL) належить до сімейства металопептидаз М20 і має широку субстратну специфічність для дипептидів [1, 2]. Він активний лише як гомодимер [3], а каталітичний домен кожної димерної субодиниці має один активний центр із двома іонами Mn 2+ або Zn 2+, які визначають специфічність ферменту для його фізіологічних субстратів [4]. На сьогодні CNDP2 є єдиною відомою протеазою, яка може каталізувати утворення псевдодипептидів молочної кислоти та амінокислот (N-лактоїл-амінокислот) шляхом зворотного протеолізу in vivo [5]. Таким чином, крім своєї протеолітичної активності, CNDP2 може виконувати інші клітинні функції.

Похибка експресія CNDP2 пов'язана з пухлинним генезом у людей. Знижений рівень CNDP2 спостерігався при раку підшлункової залози, гепатоцелюлярній карциномі та раку шлунка [2, 6, 7]. Ізоформа CNDP2, CPGL-B, у якій відсутня частина каталітичного домену, також брала участь у супресії пухлини, але наразі невідомо, чи має CPGL-B пептидазну активність [2, 6, 7]. Однак не всі пухлини характеризуються низьким рівнем CNDP2. Попередньо регульована експресія CNDP2 справді спостерігалася при раку молочної залози та раку нирок та товстої кишки [8–11]. Кілька досліджень були присвячені розумінню внеску CNDP2 у канцерогенез [2, 6–11], але модель тварин з мутованим CNDP2 наразі недоступна.

Білок CNDP2 є висококонсервативним серед видів [1, 12–14] і повсюдно експресується ([1]; База даних про гени та геноми дрозофіли, доступна на flybase.org [15]). У клітинах миші та людини CNDP2 локалізується в цитозолі та нуклеоплазмі (Атлас людського білка доступний на www.proteinatlas.org [16]); у тимчасово трансфікованих клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО) у цитоплазматичній фракції виявлено CNDP2 [1]. У D. melanogaster є лише один ген CNDP2 (CG17337; flybase.org [15]), надалі іменований dCNDP2. Вирівнювання амінокислотних послідовностей найдовшої ізоформи людського CNDP2 (475 амінокислот; номер приєднання GenPept> NP_060705.2) та найдовшої ізоформи Drosophila dCNDP2 (478 амінокислот; приєднання GenPept> NP_610181.2) виявлено 63 % ідентичності послідовності по всій довжині поліпептиду. Серед небагатьох генів D. melanogaster, що кодують білки металопептидази М20, повсюдно експресується лише dCNDP2 з помірним та високим рівнем (flybase.org [15]). Показано, що продукт цього гена є позаклітинним компонентом личинкової гемолімфи [17, 18], але його субклітинна локалізація невідома.

Для вирішення ролі CNDP2 у рості та проліферації клітин ми вирішили використати D. melanogaster як модельну систему. Легкість проведення геномних маніпуляцій у мух дозволяє досліджувати процеси як на організмі, так і на клітинах. У цьому дослідженні ми створили нульовий мутант dCNDP2, трансгенні лінії для індуцибельної експресії dCNDP2, поліклональні антитіла проти dCNDP2 і використовуємо ці інструменти для початкової характеристики білка.

Методи

Літати запаси

Мух вирощували та схрещували при 25 ° C за стандартними процедурами. Були використані наступні рядки Блумінгтонського фонду запасів дрозофіли (Блумінгтон, ІН; bdsc.indiana.edu): # 1824 (y 1 w *; P + mW.hs = GawB> AB1); # 32186 (w *; P + t7,7 w + mC = 10xUAS-IVS-mCD8: GFP> attP40); # 4775 (w 1118; P + mC = UAS-GFP.nls> 14); # 24488 (y 1 MZH-2A w *; MZH-102D); # 51325 (w 1118; PBac + mDint2 = vas-Cas9, U6-tracrRNA> VK00027) та # 6599 (y 1 w 67c23) як контролер дикого типу. Запас, що містить трансген нано-Крі [19] та лінію PattP154 [20], люб'язно надали Степан Н. Белякін та Сергій А. Демаков, відповідно (ІМЦБ СО РАН, Новосибірськ, Росія).