Оцінка мікробної екології метаногенів жуйних порід у великої рогатої худоби з різними кормами

АНОТАЦІЯ

Побудова бібліотек 16S рРНК. Окрему загальну ДНК, витягнуту з рідини рубця, розбавляли до концентрації 50 нг мкл -1 і об'єднували шляхом змішування 2 мкл кожного зразка ДНК від ефективних тварин (n = 29) (бібліотека 1) та неефективних тварин (n = 29) ( бібліотека 2) для будівництва бібліотеки. Частковий ген 16S рРНК (~ 800 п.н.) ампліфікували універсальною парою праймерів Met 86f/Met 915r (табл. 1), використовуючи таку програму: початкова денатурація протягом 5 хв при 94 ° C; 30 циклів при 94 ° С протягом 30 с, 57 ° С протягом 30 с і 68 ° С протягом 1 хв; і остаточне подовження протягом 7 хв при 68 ° С. Розчин ПЛР (50 мкл) містив 1 мкл 20 пмоль кожного праймера, 1 мкл 10 мМ дезоксинуклеозиду трифосфату, 2,5 од. Taq полімерази (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія), 1 × ПЛР-буфер, 1 мкл 50 мМ MgCl2, і 1 мкл об’єднаної матриці ДНК. Потім ампліфіковані ПЛР-продукти клонували у вектор TOP10 (набір для клонування TOPO TA; Invitrogen) за допомогою хімічної трансформації. Потім колонії з інсерцією відбирали на середовищі S-Gal (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі), і плазмідну ДНК екстрагували за допомогою екстракційного набору плазміди Millipore (Millipore, Billerica, MA).

екології

Праймери, використані в цьому дослідженні для націлювання на гени 16S рРНК метаногену

Секвенування та філогенетичний аналіз. З бібліотек 1 та 2 було випадковим чином відібрано 624 та 672 клони, які були піддані аналізу послідовностей за допомогою системи секвенування ABI 3730, використовуючи комплект послідовності циклів ABI PRISM BigDye Terminator версії 3.1 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Реакцію послідовності проводили з 10 мкл розчину, що містить 0,5 мкл BigDye, 3,2 пмоль M13 Forward (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) або M13 Reverse (TTCACACAGGAAACAGCTATGAC) праймер, 2,0 мкл 5-кратного буфера секвенування та 20 нг плазмідної ДНК як матриці. Всі послідовності були піддані пошуку BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) для визначення найближчого відомого таксону та вирівняні за допомогою програми ClustalW (http://www.ebi.ac. uk/Tools/clustalw2 /). Філогенетичний аналіз проводили за допомогою методу приєднання сусідів з пакетом PHYLIP (версія 3.67) (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Номери початкової стрічки, отримані з 1000 повторень, були призначені поруч з вузлами для перевірки кластеризації послідовностей.

Клоновий аналіз бібліотеки. Потім отримані бібліотеки аналізували за допомогою програми Mothur (Mothur v1.3.0, http://www.mothur.org/wiki/Main_Page) шляхом порівняння оперативних таксономічних одиниць (OTU) на основі 97% подібності між послідовностями. Матриці відстані були розраховані за допомогою програми DNADIST в рамках програмного пакету PHYLIP. Аналіз розрідження структури бібліотеки проводився за принципом програми DOTUR (28). Індекси різноманітності, такі як індекс Шеннона, індекс Сімпсона та індекс Чао1, використовувались для вимірювання різноманітності кожної бібліотеки. Відмінності між бібліотеками аналізували шляхом порівняння рівнів охоплення зразків, схожості членства в громаді (індекс Окіая) та структур громади (індекс Брея-Кертіса) на основі принципу в програмі ∫-LIBSHUFF (27). Різноманітність спільноти порівнювали у філогенетичному контексті, використовуючи тест значимості UniFrac та тест P у межах UniFrac (18).

Праймери, використані в цьому дослідженні для аналізу qRT-ПЛР

Статистичний аналіз. Кількість копій та пропорції конкретних видів метаногенів отримували від кожної особини, а середнє значення використовували для статистичного аналізу. Тест Стьюдента використовували для перевірки різниці у кожному цільовому виді метаногену між тваринами L-RFI та H-RFI. Проста змішана коваріаційна модель була використана для кореляції популяції метаногену з виробленням летких жирних кислот та RFI за допомогою системи SAS (версія 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Значимість була визначена за значеннями Р нумерації приєднання нуклеотидної послідовності. Послідовності нуклеотидів, створені в результаті цієї роботи, були депоновані у GenBank під номерами приєднання FJ579097 до FJ580045.

РЕЗУЛЬТАТИ

Порівняння послідовностей, створених з бібліотек клонів 16S. Для ідентифікації метаногенних профілів у рубці використовували різні комбінації універсальних метаногенних праймерів для ампліфікації повних або часткових генних продуктів 16S рРНК для побудови бібліотеки. Але спроба генерувати повний фрагмент 16S рРНК із комбінацією 21F (29) та 1389-1406R (17), як описано Ohene-Adjei та співавт. (25) не був успішним, хоча ці праймери успішно націлювали загальний вміст метаногенів у рубці овець. Застосування Met 86f/Met 1340r, як зазначено Райтом та Піммом (39), та комбінація праймерів 21F/Met 1340r не змогли генерувати продукти ПЛР від усіх тварин. Встановлено, що лише пара праймерів Met 86f/Met 915r, націлена на частковий продукт гена 16S рРНК (~ 800 bp), генерує амплікони з усіх 58 зразків рубця. Тому цю пару праймерів використовували для ампліфікації об’єднаної ДНК рубця для побудови бібліотеки.

Загалом було отримано 482 та 490 послідовностей з бібліотеки 1 (об'єднані тварини з L-RFI) та бібліотеки 2 (тварини з об'єднаними H-RFI) відповідно. З рубців тварин L-RFI (бібліотека 1) 478 з 482 послідовностей було визначено метаногенами, тоді як 471 з 490 послідовностей було визначено метаногенами з рубців тварин H-RFI (бібліотека 2). Було виявлено, що послідовності, визначені неметаногенами, 4 послідовності з бібліотеки 1 та 19 послідовностей з бібліотеки 2 належать до 13 бактеріальних філотипів. Оскільки до 16 bp послідовностей праймерів відповідають одній і тій же області бактерій, не дивно, що універсальні метаногенні праймери також можуть ампліфікувати деякі групи бактерій. Ці послідовності не були включені для аналізу метаногенних спільнот.