Окислені ліпіди в раціоні прискорюють розвиток жирних смуг у кроликів, що харчуються холестерином

Від Медичного центру Департаменту у справах ветеранів (IS, JHR, KRF) та відділів хірургії (IS, JHR, X.-MP), медицини (KRF) та Інституту серцево-судинних досліджень (JHR, DAH), Каліфорнійський університет, Сан Франциско.

Анотація

Анотація Дослідження показали, що окислені ліпопротеїни можуть відігравати певну роль при атеросклерозі. Нещодавно ми продемонстрували, що рівні окислених ліпопротеїдів у циркуляції можуть бути прямо пов'язані з кількістю окислених ліпідів у раціоні. У цьому дослідженні перевірено гіпотезу про те, що окислені з раціоном ліпіди прискорюють розвиток атеросклерозу. Протягом 12-14 тижнів 36 самців новозеландських білих кроликів годували дієтою з низьким вмістом холестерину (0,25%), що містила або 5% неокисленої кукурудзяної олії (контрольна дієта), або 5% окисленої кукурудзяної олії (окисно-ліпідна дієта). Рівні холестерину в сироватці крові зросли в однаковій мірі в обох групах, причому більша частина холестерину в β-мігруючій ліпопротеїні дуже низької щільності (β-ЛПНЩ). β-ЛПНЩ від контрольних тварин містив 3,86 ± 0,57 проти 9,07 ± 2,14 нмоль кон'югованих дієнів на мкмоль холестерину ( 100% збільшення загального холестерину в легеневій артерії, що було головним чином за рахунок збільшення ефіру холестерилу. Окислені ліпіди часто присутні в типовій дієті США, і наші результати показують, що споживання цих продуктів може бути важливим фактором ризику розвитку атеросклерозу.

Недавні дослідження в нашій лабораторії показали, що окислені ліпіди в раціоні можуть відігравати значну роль у окисленні ліпопротеїнів in vivo. У щурів рівні окислених ліпідів у хіломікронах, які були виділені з мезентеріальної лімфи та у фракції ЛПНЩ + ЛПНЩ у сироватці крові, можуть безпосередньо корелювати з кількістю окислених ліпідів у раціоні. 13 14 Подібним чином у людей споживання дієт з високим вмістом окислених ліпідів також призводить до збільшення окислених ліпідів у фракції хіломікрону після їжі. 15 16 Ці результати дозволяють припустити, що окислені ліпіди в раціоні можуть бути основним фактором, що сприяє рівню окислених ліпідів у кишкових ліпопротеїнах та ендогенних частинках ліпопротеїдів, таких як ЛПНЩ і ЛПНЩ.

Враховуючи очевидну важливість дієтичного регулювання концентрацій окислених ліпопротеїнів у циркуляції крові та роль окислених ліпопротеїдів в атеросклерозі, ми висунули припущення, що окислені в їжі ліпіди можуть бути атерогенними. Це дослідження перевіряє гіпотезу, згідно з якою окислені ліпіди в раціоні прискорюють розвиток атеросклерозу.

Методи

Модель тварини

Тридцять шість новозеландських білих кроликів (віком від 10 до 11 тижнів; початкова вага 2 кг) були розділені на дві рівні групи. Протягом експериментального періоду від 12 до 14 тижнів 6 кроликів загинуло через те, що вони відмовились від їжі, а у 2 не розвинулась гіперхолестеринемія протягом періоду годування холестерином. Кроликів розміщували індивідуально в клітках з нержавіючої сталі в приміщенні для тваринників Сан-Франциско, яке акредитоване Американською асоціацією з акредитації лабораторій по догляду за тваринами. Усі процедури були розглянуті та затверджені Інституційним підкомітетом з догляду за тваринами.

Дієти та експериментальний протокол

Щоб адаптувати кроликів до синтетичного раціону, протягом першого тижня до синтетичного раціону було додано 30% (мас./Мас.) Звичайної лабораторної кролячої чау (№ 5326, Пуріна). Протягом другого тижня концентрація чау була знижена до 15%. Протягом третього та наступних тижнів кроликів годували лише синтетичним раціоном. Кількості вищезазначених дієт були відрегульовані таким чином, що всі тварини споживали весь свій щоденний обсяг їжі (80 г/день), і тому мали постійний прийом їжі. Вагу кроликів контролювали протягом експерименту, і як контрольна група, так і групи з окисленою дієтою мали подібний приріст ваги під час експерименту. Ми вимірювали рівень холестерину в сироватці крові кожні 2 тижні після голодування тварин протягом ночі, щоб визначити рівень холестерину для кожного кролика. Оскільки тяжкість ураження артеріальних жирових прошарків залежить від концентрації холестерину в сироватці крові, 9 10 вплив холестерину розраховували як AUC (програмне забезпечення MacDraft and Cricket Graph) концентрації холестерину в сироватці крові у порівнянні з часом (12-14 тижнів), як описано 10 і дається в мілімолях на літр разів на добу. Рівні ТГ у сироватці крові у кроликів вимірювали на початку та в кінці експерименту.

Аналіз ліпідів у сироватці крові

Через 12-14 тижнів кроликів евтаназували (200 мг/кг пентобарбіталу IV) парами (по одному контрольному кроликові на кожного кролика, якого годували окислено-ліпідною дієтою) після нічного голодування і збирали кров. Ліпопротеїни виділяли послідовним ультрацентрифугуванням 24 у діапазоні щільності від 1,006 до 1,019 (β-ЛНПНЩ), 1,019-1,063 (ЛПНЩ) та 1,063-1,225 (ЛПВЩ) г/мл. Усі зразки сироватки та ліпопротеїдів включали 1 мкмоль/л ЕДТА та 100 мкг/мл гентаміцину сульфату. Концентрації ЕДТА були низькими, щоб мати мінімальний вплив на вимірювання кон'югованого дієну. Однак у дослідному експерименті, в якому порівнювали концентрації ЕДТА 1 мкмоль/л та 50 мкмоль/л, не було різниці в рівні окиснення у фракціях ліпопротеїнів. Вимірювали холестерин у сироватці та фракціях ліпопротеїнів, щоб визначити розподіл холестерину серед ліпопротеїдів.

Оцінка окислення

Морфологічне дослідження атеросклеротичних уражень

В кінці експерименту кроликам знеболювали кетамін та ксилазин (35 та 10 мг/кг маси тіла відповідно). Скрині розкривали, кроликам кровили серцеву пункцію, а потім вбивали передозуванням пентобарбіталу (200 мг/кг маси тіла). Після лапаротомії видалили аорту та легеневі артерії. Аорту розсікали від аортального клапана до роздвоєння клубової кістки і видаляли якомога більше адвентиції, щоб запобігти помилкам під час фарбування судини IV суданом. Аорта була розкрита поздовжньо і закріплена рівно на поверхні пінополістиролу. Після фіксації протягом ночі у 10% формаліні (забуференний Formalde-Fresh, Fisher Scientific Co) аорту промивали 70% етанолом протягом 10 хвилин, а потім фарбували 0,5% Судану IV у 35% етанол – 50% ацетоні протягом 20 хвилин. Знебарвлення проводили протягом 20 хвилин у 80% етанолі. Відкладення ліпідів в аорті визначали за допомогою морфологічної оцінки відсотка покритої ураженнями аорти, як візуалізується за допомогою фарбування Судану IV області між коренем аорти та біфуркацією. Пошкодження жирової смуги на збільшених фотографіях відстежували на цифровому планшеті (Kurta IS/ADB, Inmac Inc), а площі ураження вимірювали за допомогою програмного забезпечення MacDraft на комп’ютері Macintosh.