Оксид азоту опосередковує аномальний тубулогломерулярний зворотний зв’язок у щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом NaCl після проміжних підсумків
Відділ нефрології-гіпертонії, система охорони здоров'я Сан-Дієго і Каліфорнійський університет, Медичний факультет Сан-Дієго, Ла-Холла, Каліфорнія
Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: S. C. Thomson, Div. нефрології-гіпертонії, VASDHS, 3350 La Jolla Village Dr., 9111H, Сан-Дієго, Каліфорнія 92161 (електронна пошта: [електронна пошта захищена]).
Анотація
Протоколи мікропунктури.
В експериментах, призначених для перевірки ролі NOS макули дензи в аномальному TGF, TGF тестували в деяких нефронах із використанням стандартного ATF та в інших нефронах, де був блокатор NOS, N-монометил l-аргінін (L-NMMA; 10-4 M) доданий до ATF. Таким чином, у цих експериментах було дві перфузії/колекції на нефрона.
В експериментах, призначених для перевірки ролі cTGF в аномальному TGF, реакції TGF вимірювали в кожному нефроні до і під час додавання бензамілу до перфузату. Отже, на нефрон було чотири перфузії/колекції. Це було досягнуто шляхом введення двох мікроперфузійних піпеток нижче за восковим блоком. Одна з цих піпеток містила лише ATF, а інша - ATF плюс бензаміл (10-5 М). Бензаміл є потужним блокатором ENaC (1), а посилені відповіді TGF під час мікроперфузії бензамілу - звичайний тест, який використовується для демонстрації cTGF в опублікованих звітах (5, 8, 21, 22). Після збору контрольної реакції TGF петля Генле була перфузована бензамілом, і піпетки ATF кожну встановлювали зі швидкістю 15 нл/хв протягом 3-4 хв. Під час максимальної та мінімальної стимуляції TGF піпетку бензамілу встановлювали відповідно на 15 або 8 нл/хв, а піпетку ATF регулювали, щоб надати відповідну загальну швидкість перфузії. Для мікроаналізу кожен збір трубчастої рідини переносили у скляну піпетку з постійним отвором для вимірювання пізньої проксимальної швидкості потоку (VLP). Потім зразок підраховували на радіоактивність для визначення SNGFR.
Статистика.
Статистичний аналіз проводили за допомогою ANOVA, аналіз коваріації (ANCOVA) та повторні вимірювання ANOVA, відповідно. Лікування та окремі тварини були включені як незалежні змінні в регресії. Помилка ступеня свободи полягала в кількості нефронів, меншому за модельний ступінь свободи. Це є більш суворим, ніж те, що зазвичай роблять з даними мікропунктури, тобто призначають ступінь свободи кожному нефрону та ігнорують можливий вплив неоднорідності між тваринами. У цьому випадку ANOVA підтвердила відсутність ефекту між тваринами в обох наборах експериментів, тому однаковий статистичний результат міг бути досягнутий, ігноруючи ефект тварини. Аналіз проводили за допомогою фірмового програмного забезпечення (Systat, Evanston, IL).
Вплив LNMMA на SNGFR та відповідь TGF.
Серія LNMMA включала 210 пізніх проксимальних трубчастих рідин від шести тварин STN HS та шести штучних тварин HS. Всіх тварин годували дієтою ГС з першого післяопераційного дня. Мікропункція була зроблена на післяопераційному періоді дні 8–10. Раніше інфарктовані полюси нирки були скарифіковані. Поверхня неінфарктної частини виглядала здоровою із збільшеними канальцями та хорошим тургором для полегшення мікропунктури. Гістологія на цій стадії НТН демонструє гіпертрофію канальців та гіперплазію та легкий гломерулосклероз (11).
Дані SNGFR наведені в таблиці 1 та на рис. 1. Відповіді TGF були відносно однорідними серед тварин у кожній групі ( = 0,87 за тестом ANOVA на різницю між тваринами у відповіді TGF). Під час мінімального стимулювання TGF, SNGFR не суттєво відрізнявся між STN HS та Sham HS. Під час максимального стимулу TGF, SNGFR був удвічі вищим у STN HS, ніж фіктивний HS (
Таблиця 1. Результати SNGFR для експериментів LNMMA
Значення виражаються як середні значення ± SE. (+) та (-) стосуються максимального та мінімального стимулу TGF. Сер. - SNGFR у середній точці TGF. Реакція TGF - зміна SNGFR, коли стимул TGF зменшується з максимального до мінімуму.
* = 0,054 для середньої реакції TGF, яка є негативною за одностороннім т-тест.
† = 0,0007 для ефекту LNMMA в STN HS по Student's т-тест.
Рис. 1.Лінійні графіки відображають реакції тубулогломерулярного зворотного зв’язку (TGF) для окремих нефронів, коли петля Генле пронизана LNMMA або без неї. TGF (+) позначає максимальний стимул TGF. TGF (-) позначає мінімальний стимул TGF. Графіки Tukey Box показують, як відповіді TGF розподіляються в межах кожної групи. Зміна швидкості клубочкової фільтрації з одним нефроном (ΔSNGFR) є різницею у SNGFR між TGF (-) та TGF (+). Відповідь TGF аномальна, якщо ΔSNGFR
Вплив бензамілу на SNGFR та відповідь TGF.
Серія бензамілу включала 132 пізні проксимальні трубчасті колекції рідини від чотирьох тварин STN HS та чотирьох тварин Sham HS (чотири колекції на нефрон). Дані SNGFR наведені в таблиці 2 та на рис. 2. Кореляційна матриця Пірсона для чотирьох вимірювань SNGFR у кожному нефроні показана в таблиці 3. Ефекти бензамілу на SNGFR не відрізнялися у тварин ( = 0,99 і = 0,97 для неоднорідності між тваринами в STN HS або Sham HS). Чотири колекції на нефрон у цих експериментах включали відповіді TGF до і під час бензамілу в кожному нефроні, щоб оптимізувати статистичну потужність для виявлення ефектів бензамілу шляхом сполучення. Двосторонній ANOVA з дизайном для повторних заходів був проведений для тестування на вплив на TGF-відповідь STN HS проти Sham HS (частина суб'єкта ANOVA) та на ефекти бензамілу (частина ANOVA у суб'єктів). Ефект STN HS між суб'єктами підтвердив, що TGF був придушений або парадоксальний при STN HS щодо Sham HS ( = 0,002). Щодо частини ANOVA у суб’єктів, не спостерігалося значного впливу бензамілу на загальну відповідь TGF ( = 0,3) і відсутність значного впливу бензамілу на різницю у відповіді TGF між STN HS та Sham HS ( = 0,4).
Таблиця 2. Результати SNGFR для експериментів з бензамілом
Значення виражаються як середні значення ± SE. (+) та (-) стосуються максимального та мінімального стимулу TGF. Сер. - SNGFR у середній точці TGF. Відповідь TGF - зміна SNGFR, коли стимул TGF змінився з максимального на мінімальний.