Опосередкований PepT1 трипептид KPV зменшує запалення кишечника
Пов’язані дані
Анотація
Передумови та цілі
KPV - це трипептид (Lys-Pro-Val), який має протизапальні властивості, проте механізми його дії досі залишаються невідомими. PepT1 - це ди/трипептидний транспортер, який експресується в тонкій кишці та індукується в товстій кишці під час запального захворювання кишечника (ВЗК). Метою цього дослідження було 1) дослідити, чи протизапальний ефект KPV опосередкований PepT1 в епітеліальних та імунних клітинах кишечника, та 2) вивчити протизапальний ефект KPV на двох моделях коліту мишей.
Методи
Клітини кишкового епітелію людини (Caco2-BBE та HT29-Cl.19A) та Т-клітини людини (Jurkat) стимулювались протизапальними цитокінами у присутності або відсутності KPV. Протизапальний ефект KPV оцінювали за допомогою репортера гена люциферази NF-κB, вестерн-блот, RT-PCR в реальному часі та ІФА. Експерименти з поглинанням проводили з використанням холодного KPV як конкурента для hPepT1 радіомаркованого субстрату або з використанням [3 H] KPV для визначення кінетичних характеристик поглинання KPV. Протизапальний ефект KPV також досліджували при DSS- та TNBS-індукованому коліті у мишей. KPV додавали до питної води, і запалення оцінювали на гістологічному рівні та за допомогою експресії прозапальної мРНК цитокінів.
Результати
Наномолярні концентрації KPV інгібують активацію сигнальних шляхів запалення NF-κB та MAP-кінази та зменшують прозапальну секрецію цитокінів. Ми виявили, що KPV діє через hPepT1, що експресується в імунних та кишкових епітеліальних клітинах. Крім того, пероральне введення KPV зменшує частоту виникнення DSS- та TNBS-індукованого коліту, що вказує на зменшення експресії прозапальних цитокінів.
Висновок
Це дослідження вказує на те, що KPV транспортується в клітини за допомогою PepT1 і може бути новим терапевтичним засобом для ВЗК.
ВСТУП
Однією з нормальних транспортних функцій епітеліальних клітин кишечника є поглинання дрібних пептидів з раціону за допомогою пептидної транспортної активності (1). Це опосередковується за допомогою Н + -сполученого транспортера олігопептидів (PepT1), який знаходиться на апікальній мембрані епітеліальних клітин кишечника (IEC) і який котранспортує пептиди та Н + (2). Специфічність hPepT1 широка і включає багато ді- та трипептидів на додаток до різних препаратів, отриманих із пептидів (3–8). PepT1 в основному експресується в мембранах меж щітки ентероцитів у тонкому кишечнику, у проксимальних канальцевих клітинах сегмента S1 нирки та в епітеліальних клітинах жовчних проток (4, 5, 9–15). Навпаки, в товстій кишці експресія мРНК і білка PepT1 є низькою (16) і іноді не може бути виявлена (10, 15, 17). Хоча людський PepT1 не експресується в нормальних епітеліальних клітинах товстої кишки (10, 16, 17), ми виявили його експресію на апікальній мембрані епітеліальних клітин у хронічно запаленій товстій кишці (17). Цікаво, що ми також показали, що імунні клітини, такі як макрофаги, які тісно контактують із власною пластинкою кишечника, також експресують PepT1 у своїх мембранах (17, 18).
Оскільки експресія hPepT1 товстої кишки регулюється вгору при ВЗК, його транспортна активність становить потенційну нову мішень для протизапальної терапії. Крім того, слід оцінювати важливість експресії hPepT1 імунними клітинами під час запалення кишечника, оскільки може бути терапевтично вигідним розвиток опосередкованих PepT1 протизапальних препаратів. Трипептид KPV (Lys-Pro-Val), який є С-кінцевою послідовністю α-меланоцитостимулюючого гормону (α-MSH), має протизапальну активність (19–21), і хоча основні механізми ще потрібно визначити, відомо, що KPV інгібує активацію NF-κB, вказуючи на інгібування синтезу прозапальних цитокінів. У цьому дослідженні ми досліджуємо трипептид KPV як медіатор протизапальних ефектів через PepT1, що виражається у запалених епітеліальних та імунних клітинах товстої кишки, а також його протизапальні властивості in vivo, використовуючи мишачі моделі коліту.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Культура клітин
Клітини Caco2-BBE і HT29-Cl.19A вирощували в DMEM з добавкою 14 мМ NaHCO3, 10% FBS і пеніциліном/стрептоміцином (Invitrogen, Grand Island, NY). Клітини Jurkat вирощували в RPMI 1640 (Invitrogen) з додаванням 10% FBS.
Реагенти
Тварини
Самки мишей C57BL/6 (8 тижнів, 18–22 г, лабораторії Джексона, Бар-Харбор, МЕ), що використовувались для цього дослідження, розміщувались у групі при контрольованій температурі (25 ° C) та фотоперіоді (12: 12-годинний цикл світло-темрява ), і дозволив необмежений доступ до стандартної дієти та водопровідної води. Мишам дозволяли пристосуватися до цих умов щонайменше за 7 днів до включення в експерименти.