Підхід до біодеградації поліетилену низької щільності Bacillus amyloliquefaciens SpringerLink
Анотація
Поліетилен низької щільності (ПВД) є основною причиною стійкого та довгострокового забруднення навколишнього середовища. У цій роботі два бактеріальних ізоляти Bacillus amyloliquefaciens (BSM-1) та Bacillus amyloliquefaciens (BSM-2) були виділені з твердого муніципального ґрунту та використані для досліджень деградації полімерів. Мікробна деградація LDPE була проаналізована шляхом сухого зменшення ваги плівки LDPE, зміни рН культурального середовища, оцінки CO2, скануючої електронної мікроскопії (SEM) та інфрачервоної FTIR-спектроскопії поверхні плівки з перетворенням Фур'є. SEM-аналіз показав, що обидва штами демонстрували прихильність та ріст за допомогою ПВД, який використовувався як єдине джерело вуглецю, тоді як зображення FTIR показували різні хімічні зміни поверхні після 60 днів інкубації. Бактеріальні ізоляти показали деполімеризацію продуктів біологічного розкладу у позаклітинних середовищах, що вказує на процес біологічного розкладання. BSM-2 демонстрував кращу деградацію, ніж BSM-1, що доводить потенціал цих штамів деградувати плівки LDPE за короткий проміжок часу.
Вступ
Поліетилен низької щільності (ПВД) - широко застосовуваний не біологічно розкладається термопластик. Для вирішення цієї екологічної проблеми, пов’язаної з небіодеградуючими термопластиками, великий інтерес представляють дослідження модифікації небіодеградуючих термопластів на біологічно розкладаються матеріали (Zheng et al. 2005). Крім того, ці синтетичні полімери зазвичай не піддаються біологічному розкладанню, поки вони не розкладаються на фрагменти з низькою молекулярною масою, які можуть засвоюватися мікроорганізмами (Френсіс та ін., 2010).
Матеріали і методи
Попередня обробка та приготування порошку з ПВД
Поліетилен низької щільності (LDPE) був отриманий від B.N. Полімери, Бангалор, Індія. Плівки ПВД розрізали на дрібні шматочки, занурили в ксилол і кип'ятили протягом 15 хв з подальшим подрібненням блендером при 3000 об/хв. Як отриманий порошок ПЕНЩ додатково промивали етанолом, сушили протягом ночі в духовій шафі з гарячим повітрям при 60 ° C і зберігали при кімнатній температурі для подальшого використання.
Поліетилен, що руйнує бактерії та умови культивування
Бактерії, використані в цьому дослідженні, B. amyloliquefaciens (BSM-1) (номер приєднання GenBank № KC924446) та B. amyloliquefaciens (BSM-2) (номер приєднання GenBank № KC924447) (Das and Kumar 2013), були виділені із зони звалища твердих побутових відходів, Паллікаранаі (12.9377N/80.2153E, 7 м над рівнем моря), Ченнаї, Індія та підтримуються на поживний агар при 4 ° С. Бактерії, що руйнують полімер, були ідентифіковані за допомогою синтетичних середовищ, доповнених 0,3% порошком ПВД. Склад синтетичного середовища був таким: (г/л: K2HPO4, 1; KH2PO4, 0,2; (NH4) 2SO4, 1; MgSO4 · 7H2O, 0,5; NaCl, 1; FeSO4 · 7H2O, 0,01; CaCl2 · 2H2O, 0,002; MnSO4 · H2O, 0,001; CuSO4 · 5H2O, 0,001; ZnSO4 · 7H2O, 0,001; агар 15; pH 7,0).
Дослідження біодеградації
Тести на біологічне розкладання проводили з 3 г зразків плівок ПВД (1,5 × 1,5 см), які сушили протягом ночі при 60 ° C, зважували, знезаражували (30 хв у 70% етанолі), сушили на повітрі протягом 15 хв у камері повітряного потоку Laminar і додавали в колби Ерленмейера, що містять 300 мл синтетичного середовища. Дослідження деградації LDPE проводили з використанням обох штамів бактерій окремо. Кожну колбу, інокульовану 3 мл 24 год старої культури (BSM-1 та BSM-2), вирощеної на середовищі, доповненому LDPE, використовували як інокуляти, щоб уникнути будь-якої пов'язаної фази тривалого відставання. Потім культури інкубували на роторному шейкері (Neolab Instruments) при 33,3 ° C і 130 об/хв протягом 60 днів. Кожен тест складався з трьох повторень.
Вимірювання біодеградації
Визначення зміни рН
Дослідження зміни рН було прийнято, щоб переконатись у будь-якій метаболічній активності штаму мікробів у середовищі, що містить добавки, оскільки метаболізм, показаний мікробними клітинами, може значною мірою підтвердити докази деградації. Під час дослідження рН кожної бактеріальної суспензії вимірювали з інтервалом у 10 днів. Зонд рН вводили в бульйон для вимірювання рН. Вихідне значення середовища було забезпечено 7 ± 0,3 для обох штамів з використанням фосфатного буфера.
Визначення сухої маси залишкового полімеру
Для полегшення точного вимірювання ваги залишкового поліетилену листки поліетилену відновлювали через 60 днів інкубації і змивали бактеріальну біоплівку з поверхні полімеру 2% -ним (об/об) водним розчином додецилсульфату натрію протягом 4 год. (за допомогою шейкера), потім дистильованою водою і, нарешті, 70% етанолом, щоб забезпечити максимально можливе видалення клітин та сміття. Вимиті шматки полімеру поміщали на фільтрувальний папір і сушили протягом ночі при кімнатній температурі перед зважуванням.
Тест на виділення СО2
Був розроблений самомодифікований простий апарат, який складається з контрольних і випробувальних посудин, а в систему для аерації подавали стерильне повітря. Тут полімер, інкубований з мікробами, служив тестом, а полімер без мікробів - контролем. Після інкубації як метаболічний, так і атмосферний СО2 із досліджуваної посудини та атмосферний СО2 із контрольної посудини потрапляли в пастку та оцінювали, використовуючи “тест Штурма” (Sturm 1973) для кожного ізоляту.
Скануюча електронна мікроскопія (SEM)
Неочищені та оброблені зразки через 60 днів тривали СЕМ-аналіз (після промивання 2% (об./Об.) Водним SDS та дистильованою водою багаторазово шляхом легкого струшування протягом декількох хвилин і додатково промивали 70% етанолом з метою видалення клітин, щоб отримати максимальну поверхню, яку можна виставити для візуалізації. Зразки наклеювали на SEM Sample Stub за допомогою вуглецевої стрічки, а зразок покривали золотом протягом 40 с і аналізували під скануючим електронним мікроскопом з високою роздільною здатністю (JEOL, Model JSM -6390LV).
Аналіз FTIR
Інфрачервоні спектроскопічні дослідження з перетворенням Фур'є були проведені для контрольних та оброблених бактеріями плівок ПВД. Аналіз проводили за допомогою FTIR-спектроскопії Perkin-Elmer Spectrum-One в горизонтальному режимі з дисками броміду талію.
Результати і обговорення
Біорозкладаний пластик є сприятливим рішенням проблеми утилізації або накопичення пластику в природі. Оскільки побутові та промислові відходи містять величезну кількість поліетилену низької щільності, у цій роботі був зібраний зразок твердих побутових відходів для виділення мікроорганізмів, які виявили потужну біологічну деградацію. Бактеріальні ізоляти можуть рости в синтетичному середовищі, що доповнює LDPE, використовуючи LDPE як єдине джерело вуглецю та енергії. Ці спостереження свідчать про утворення та прикріплення біоплівки на плівці ПВД. Мікробна колонізація на поверхні полімеру є першою вимогою до його біодеградації (Yabannavar and Bartha 1993).