Підвищення рівня вільних жирних кислот викликає запалення та погіршує судинну реактивність у здоровому стані

Анотація

Щоб перевірити можливі гострі прозапальні ефекти жирних кислот, ми індукували збільшення концентрації вільних жирних кислот у плазмі крові (ВЖК) після інфузії ліпідів та гепарину протягом 4 годин у 10 здорових пацієнтів. Ми визначили активність зв’язування ядерного фактора κB (NF-κB) в мононуклеарних клітинах (MNC), субодиницю p65 NF-κB, генерацію активних форм кисню (ROS) за допомогою MNC та поліморфно-ядерні лейкоцити (PMN). Також вимірювали реактивність плечової артерії, використовуючи постішемічну дилатацію, опосередковану потоком. Активність зв'язування NF-κB в ядерних екстрактах MNC зросла до 163 ± 17% та 144 ± 14% порівняно з базальними рівнями через 2 та 4 год (P 2), які брали участь у дослідженні (табл. 1). Усі учасники мали нормальну толерантність до глюкози, не брали жодних ліків, мали нормальний артеріальний тиск та нормальний профіль ліпідів натще. Усі добровольці дали свою письмову, поінформовану згоду, і протокол дослідження був затверджений Комітетом з досліджень людини Державного університету Нью-Йорка в Баффало.

жирних

Протокол.

Учасники прийшли до клінічного дослідницького центру о 8.00 ранку, після нічного 12-годинного голодування. Катетер був введений в антекубітальну вену. Отримано вихідний зразок крові, і емульсію тригліцеридів (Liposyn, 10%; Abbott Laboratories, Північний Чикаго, Іллінойс) та гепарин (0,2 одиниці · кг -1 -1 хв -1) вливали зі швидкістю 50 мл/год протягом 4 год. Ми використовували меншу концентрацію ліпозину порівняно з більшістю попередніх досліджень, оскільки інфузія 20% ліпосину призводила до ліпемічної сироватки, де розділення МНК та ПМН було неможливим. Інфузію тригліцеридів припиняли через 4 години, а зразки крові відбирали через 0, 2, 4 та 6 годин. Судинну реактивність також вимірювали через 0, 2, 4 та 6 год. У двох різних випадках сім суб'єктів брали участь у двох інших дослідженнях, в яких протягом 4 годин вводили 0,9% нормального фізіологічного розчину або 5% декстрози, а зразки відбирали через 0, 2, 4 та 6 годин.

Ізоляція MNC та PMN.

Зразки крові відбирали у Na-EDTA як антикоагулянт. Загалом 3,5 мл зразка антикоагулянтної крові ретельно наносили на 3,5 мл середовища для ізоляції PMN (Robbins Scientific, Саннівейл, Каліфорнія). Зразки центрифугували при 450g в поворотному роторі протягом 30 хв при 22 ° C. В кінці центрифугування дві смуги відокремлювались у верхній частині гранул еритроцитів. Верхня смуга складається з MNC, а нижня - з PMN. Смугу MNC збирали піпеткою Пастера, неодноразово промивали збалансованим розчином солі Хенкса і відновлювали до концентрації 4 × 10 5 клітин/мл у збалансованому розчині солі Хенкса. Цей метод забезпечує вихід> 95% чистої суспензії МНК.

Вимірювання генерації АФК.

Аналіз зсуву електрофоретичної рухливості NF-κB.

Аналіз на затримку гелю NF-κB проводили, як описано раніше. ДНК-зв'язуючі білкові екстракти отримували з МНК методом, описаним Andrews et al. (15). Загальні концентрації білка визначали за допомогою аналізу білка BCA (Pierce, Rockland, IL). Аналіз на затримку гелю NF-κB проводили за допомогою набору для виявлення зв’язуючого білка NF-κB (Life Technologies, Лонг-Айленд, Нью-Йорк). Коротко кажучи, дволанцюжковий олігонуклеотид, що містить тандемний повтор консенсусної послідовності для сайту зв'язування NF-κB, був радіомаркірований γ-P 32 кіназою T4. Потім 5 мкг ядерного екстракту змішували з інкубаційним буфером, і суміш попередньо інкубували при 4 ° С протягом 15 хв. Додавали мічений олігонуклеотид (60000 cpm) і суміш інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хв. Потім зразки наносили на лунки 6% неденатурирующего поліакриламідного гелю. Гель сушили під вакуумом і піддавали дії рентгенівської плівки. Денситометрію проводили за допомогою програмного забезпечення для молекулярного аналізу Bio-Rad (Геркулес, Каліфорнія).