Постінфарктна дієта з високим вмістом жиру покращує функцію мітохондрій і не посилює ліворуч
Анотація
жирні кислоти (ФК) є домінуючим джерелом енергії для серця дорослих ссавців, а також використовуються для біосинтезу мембран, генерування ліпідних сигнальних молекул, посттрансляційної модифікації білка та регуляції транскрипції (43). Хронічний вплив FA може призвести до дисбалансу між поглинанням та використанням FA, що потенційно може спричинити цитотоксичні механізми, що призводить до дисфункції клітин або смерті, явища, відомого як ліпотоксичність. Широкі клінічні дослідження та дослідження на тваринах показали, що надмірне накопичення ліпідів у нежирній тканині через посилену циркулюючу ФА може відігравати важливу роль у патофізіологічних станах, таких як серцева недостатність, ожиріння, резистентність до інсуліну та діабет (15, 43, 58).
Посилене накопичення ліпідів міокарда, схоже, пов'язане з порушенням скорочувальної функції міокарда. Однак вплив посиленого накопичення ліпідів та збільшення виробництва кераміду на функцію мітохондрій та їх супутній вплив на функцію шлуночків при патофізіологічних станах, таких як серцева недостатність, системно не оцінювались. Це дослідження було розроблене для перевірки гіпотези про те, що прогресування серцевої недостатності посилюється підвищеним рівнем ліпідів міокарда та пов'язаним з цим керамідом інгібуванням інгібування окисного фосфорилювання мітохондрій (зокрема, шляхом інгібування активності комплексу III). Ми перевірили свою гіпотезу на щурах, які харчувалися дієтою з високим вмістом насичених жирів після операції перев’язки коронарних артерій, щоб викликати серцеву недостатність.
Дизайн дослідження та індукції інфаркту міокарда.
Це дослідження було проведено відповідно до Посібник з догляду та використання лабораторних тварин, опублікована Національним інститутом охорони здоров’я (Публікація NIH № 85-23, переглянута 1996 р.) та схвалена Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Університеті Case Western Reserve Тварин утримували у зворотному режимі 12-годинного: 12-годинного циклу світло-темнота (тобто вимкнення світла о 6:00 ранку), а всі процедури та збирання тканин проводили натщесерцем між 3 і 6 год у темну фазу циклу.
На початковому етапі цього дослідження щурів годували нормальним чау (10% калорій з жиру, 20% з білка та 70% з вуглеводів) або дієтою з високим вмістом насичених жирів [60% з жирів (25% пальмітину, 33% стеаринової та 33% олеїнової кислот), 20% калорій з білка та 20% калорій з вуглеводів; Дієти дослідження] протягом 2 тижнів. Для індукції серцевої недостатності щурів знеболювали ізофлураном (1,5–2,0%), інтубували та провітрювали. Серцева недостатність була індукована лігуванням лівої головної коронарної артерії, як описано раніше (1). Як повідомляється в результатах, спостерігалася така помітна та значна хірургічна смертність у щурів, які отримували дієту з високим вмістом насичених жирів перед операцією лігування, що згодом дизайн дослідження був змінений таким чином, що всі щури залишались на нормальній дієті перед операцією лігування. Після індукції серцевої недостатності шляхом перев’язки коронарних артерій щурів випадковим чином розподіляли до будь-якої групи серцевої недостатності, яку годували нормальним харчуванням (СН)., = 8) або група серцевої недостатності, яка харчувалася дієтою з високим вмістом насичених жирів (СН + СБ, = 7) протягом 8 тижнів. Підроблені тварини (бутафорські; = 8) годували нормальним харчуванням.
Ехокардіографія.
Функцію ЛШ оцінювали за допомогою ехокардіографії перед перев’язуванням коронарних артерій та 8 тижнів після перев’язки коронарних артерій за допомогою системи Sequoia C256 (Siemens Medical) з 15-МГц лінійним перетворювачем, як описано раніше (36). Коротко, щурам знеболювали 1,5–2,0% ізофлурану за допомогою маски, голили грудну клітку, тварину розташовували в лежачому положенні на грільній подушці та ставили електроди для кінцівок ЕКГ. Двовимірні (2D), 2D-керовані М-режими та доплерівські ехокардіографічні дослідження аортальних та трансмітральних потоків проводили через парастернальні та укорочені верхівкові вікна. Кінцеві діастолічні та кінцеві систолічні розміри вимірювали за допомогою програмного забезпечення, розташованого на ультрасонографі. Індекс працездатності міокарда та відсоток дробового вкорочення розраховували, як описано раніше (36).
Гемодинамічні вимірювання.
Через вісім тижнів після перев'язки коронарних артерій була проведена термінальна хірургічна процедура для оцінки тиску та скорочувальних властивостей ЛШ. Щурів знеболювали (1,5–2,0% ізофлурану), інтубували та провітрювали. Катетер датчика тиску мікротипу (3,5 Fr, Millar Instruments) вводили через праву сонну артерію в ЛШ. Вимірювання частоти серцевих скорочень, пікового систолічного тиску ЛШ та пікової швидкості підвищення та падіння тиску ЛШ (± dP/dт) були записані протягом 30-ти років за допомогою Digi-Med Heart Performance Analyzer-τ.
Підготовка мітохондрій.
Після канюляції ЛШ проби крові відбирали з нижньої порожнистої вени. ЛШ, правий шлуночок та рубцева маса були отримані за допомогою гравіметричних вимірювань. Зразок тканини міокарда (~ 100 мг) збирали і негайно швидко заморожували. Рубець і залишок ЛШ поміщали в KME (100 мМ KCl, 50 мМ MOPS, внутрішня сіль і 0,5 мМ EGTA). Серцеві підсарколеммальні (SSM) та міжфібрилярні (IFM) мітохондрії були виділені за методикою Palmer et al. (38) за винятком того, що модифікований буфер Чаппелла-Перрі (що містить 100 мМ KCl, 50 мМ MOPS, 1 мМ EGTA, 5 мМ MgSO4 · 7H2O та 1 мМ АТФ, рН 7,4 при 4 ° C) був використаний для виділення обох мітохондріальних популяцій. IFM збирали після обробки шкірних волокон 5 мг/г вологої маси трипсину протягом 10 хв при 4 ° C (35). Концентрацію білка в мітохондріях визначали методом Лоурі, використовуючи бичачий сироватковий альбумін як стандарт.
Мітохондріальне окисне фосфорилювання.
Мітохондріальна активність комплексу ETC.
Зразки SSM та IFM (10 мг холату/1 мг мітохондріального білка) змішували в 1 мл буфера [75 мМ манітолу, 220 мМ сахарози, 2 мМ ЕДТА та 5 мМ MOPS (pH 7,4)] з коктейлем інгібітора протеази ссавців (1 мкл/1 мл буфера) і витримували на льоду. Аналізи проводили в день підготовки.
Виявлення утворення H2O2.
Продукти метаболізму плазми та тканин.
Вміст C16-кераміду в ЛШ вимірювали методом капілярної газової хроматографії з детектором полум’яної іонізації, використовуючи C17-керамід як внутрішній стандарт, як описано раніше (51). Вміст тканинного вмісту TG вимірювали в гомогенатних екстрактах за допомогою методу ферментативного спектрофотометра (Wako Chemicals, Richmond, VA). Вільні жирні кислоти у плазмі та TG вимірювали за допомогою комерційно доступного ферментативного спектрофотометричного набору (39). Концентрацію інсуліну та лептину в плазмі крові аналізували за допомогою імуноферментного аналізу ELISA (ALPCO Diagnostics, Salem, NH).
Електронна мікроскопія.
Свіжоізольовані SSM та IFM були підготовлені для просвічувальної електронної мікроскопії, як описано раніше (16).
Статистичний аналіз.
Відмінності між групами фіктивних, СН та СН + СБ визначали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу, за яким слідував Бонферроні т-тести для кількох порівнянь. Дані виражаються як групові середні значення ± SE. Для всього статистичного аналізу значення було прийнято при 2 -аналіз). З огляду на значно вищий рівень смертності у тварин, які харчувались насиченою жировою дієтою перед перев'язкою коронарних артерій, порівняно з тими, хто харчувався нормальною дієтою, групу, яка годувала високонасиченою жировою дієтою до перев'язки коронарних артерій, згодом було вилучено з дослідження через потенційне "упередження вижилих" у цій групі тварин.