Повністю транс-ретиноева кислота, покращена атеросклерозом, спричиненим дієтою, з високим вмістом жиру у кроликів шляхом інгібування
1 відділення кардіології, перша афілійована лікарня медичного університету Аньхоя, Аньхой 230022, Китай
2 Кафедра гематології, Друга приєднана лікарня Медичного університету Аньхой, Аньхой 230601, Китай
3 Лабораторія молекулярної біології, Аньхойський медичний університет, Аньхой 230032, Китай
Анотація
Передумови. Всі-переклад-ретиноева кислота (atRA) ефективна при багатьох проліферативних захворюваннях. Ми досліджували захисні ефекти atRA проти атеросклерозу. Методи. Кроликів випадковим чином розподіляли на базову дієту або HFD протягом 4 тижнів. Потім група HFD отримувала розувастатин (3 мг/добу), atRA (5 мг/кг/добу) або той самий об’єм носія відповідно протягом наступних 8 тижнів. Результати. Група HFD показала збільшення рівня ліпідів у плазмі та утворення бляшок аорти. Експресія Р-селектину та зв'язування фібриногену на тромбоцитах або відкладення на інтимі аорти також суттєво зросли, як і рівні ФНП-α, ІЛ-6 та фібриноген у плазмі. Після 8 тижнів лікування atRA спостерігалося значне зниження рівня ліпідів у плазмі та поліпшення ураження аорти. AtRA також пригнічувала експресію зв'язування P-селектину та фібриногену на тромбоцитах та відкладення на інтимі аорти. Висновок. AtRA може полегшити індуковану ВЧЧ АС у кроликів, пригнічуючи активацію та запалення тромбоцитів.
1. Вступ
Всі-переклад-ретиноева кислота (atRA) - це сімейство сигнальних молекул, які хімічно пов’язані з вітаміном А (ретинолом). AtRA має потужний вплив in vitro на низку процесів, пов’язаних з пошкодженням судин та їх відновленням, таких як модуляція проліферації гладком’язових клітин (SMC) та індукування диференціації SMC [1–4]. Нещодавно було показано, що atRA обмежує рестеноз після балонної ангіопластики на кролячій моделі [5], а також сприятливі ефекти у зменшенні маси новоутворення та викликанні геометричного ремоделювання у пошкодженій сонній артерії щурів [6]. Однак на сьогоднішній день немає повідомлень про його роль у атеросклерозі (АС), викликаному дієтою з високим вмістом жиру (HFD-).
Це дослідження було проведено для вивчення можливих терапевтичних ефектів atRA на індуковану ВЧР АС, з особливим акцентом на його потенціал інгібувати активацію тромбоцитів, запобігати запаленню та знижувати рівень ліпідів крові та зменшувати ураження аорти, тоді як розувастатин використовували як позитивний контроль.
2. Методи
2.1. Процедури для тварин
Кроликів-самців Нової Зеландії (звичайний клас) було придбано в приміщенні для експериментальних тварин у Нанкіні, Китай. Кролики (
кг) утримувались в окремих клітках при помірній температурі та мінливому освітленні (12-годинне світло, 12-годинна темрява) з доступом до їжі та чистої води. Після 3-денного періоду аклімації кроликів випадковим чином розділили на дві групи. Контрольна група (
) отримували базальну дієту, тоді як іншій групі - HFD, що включала 5% сала та 1% холестерину. Через чотири тижні тварини з групою HFD були розділені на три групи і отримували або розувастатин кальцію (3 мг/день), ATRA (5 мг/кг/день), або такий же об'єм носія шляхом внутрішньошлункового введення протягом 8 тижнів (
/ група). Розувастатин і atRA розчиняли у воді.
В кінці експерименту кролики голодували протягом 8 годин до анестезії (3% пентобарбіталу в/в, вводили в дозі 1 мл/кг). Кров збирали із загальної сонної артерії. Кроликів приносили в жертву, аорти обережно виймали і розрізали. Тканину спостерігали, а потім поміщали у 10% (мас./Об.) Нейтрального формаліну на 24 години. Експериментальні процедури на тваринах проводились відповідно до Комітету з внутрішнього догляду за тваринами та медичного університету Аньхоя та відповідали Посібнику з догляду та використання лабораторії.
2.2. Реагенти
Розувастатин кальцій був придбаний у AstraZeneca; atRA та ADP були придбані у Sigma. Тромбін був придбаний у Pharmaceutical Co., Ltd., Хунань. Анти-кролячі CD62-P кон'юговані з FITC антитіла були придбані у Біосс, Пекін. Курячі поліклональні антифібриногенні (FITC) антитіла були придбані у Abcam. Набори SP-9000/9001/9002 Histostain-Plus були придбані у ZYMED.
2.3. Збір крові та підготовка тромбоцитів
Зразки крові відбирали в пробірки, що містять 3,8% цитрату натрію (1/9 об./Об.) Для біохімічних вимірювань та проточної цитометрії. Збір крові центрифугували при 1000 g протягом 10 хвилин для збору плазми. Багату тромбоцитами плазму (PRP) отримували центрифугуванням при 300 g протягом 10 хвилин. Потім тромбоцити виділяли з PRP за допомогою PBS для промивання двічі, як описано раніше [13, 17].
2.4. Виявлення експресії тромбоцитів P-селектину (CD62-P) та зв'язування фібриногену за допомогою проточної цитометрії
Тромбоцити у спокої та тромбоцити, активовані тромбіном (1 од/мл) або АДФ (кінцева концентрація становить 20 мкМ), інкубували з кон’югованим FITC анти-кролячим CD62P або фібриногеном протягом 30 хвилин при кімнатній температурі в темряві. PBS (0,5 мл) додавали до зразка безпосередньо перед збору даних. Всі зразки аналізували за допомогою проточної цитометрії за допомогою FC500 (Бекман Коултер), використовуючи 10 000 подій на зразок із розсіяним світлом та каналами флуоресценції, встановленими з логарифмічним коефіцієнтом посилення. Популяцію тромбоцитів аналізували на середню інтенсивність флуоресценції (MFI).
2.5. Біохімічні вимірювання
Концентрації ліпідів у плазмі крові визначали за допомогою наборів для діагностичного аналізу ферментів. Фібриноген плазми, IL-6 та TNF-α вимірювали за допомогою фібриногену кролика Quantikine, IL-6 та TNF-α набір для імуноферментного аналізу (ІФА) (R&D Systems).
2.6. Морфологія та імуногістохімія
2.7. Статистичний аналіз
Весь статистичний аналіз проводився за допомогою програми SPSS, версія 13.0, для Windows. Усі дані виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). Порівняння між групами проводили за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) та методу Стьюдента-Ньюмена-Кілса (SNK). Значення
були розцінені як статистично значущі.
3. Результати
3.1. atRA Покращені ліпіди плазми у кроликів, індукованих ВЧР
Порівняно з контрольною групою, індуковане HFD значне збільшення ліпідів у плазмі крові, включаючи загальний холестерин (Total-C), холестерин ліпопротеїдів низької щільності (LDL-C), холестерин ліпопротеїнів високої щільності (HDL-C) та тригліцериди (TG) . Пероральне введення розувастатину або atRA як суттєво знижувало загальний вміст С, так і рівень ЛПНЩ, і обидва значно підвищували рівень ЛПВЩ під час годування HFD (табл. 1). Ці результати свідчать про те, що втручання atRA може допомогти відновити ліпідний дисбаланс, індукований HFD.
2 9. 3 7 ± 4. 3 6
2 4. 5 7 ± 4. 5 7
1 6. 2 7 ± 2. 4 0
1 7. 2 4 ± 4. 4 4
1 2. 9 2 ± 3. 1 9
порівняно з контрольною групою; ▲
3.2. поліпшені артеріальні бляшки atRA у кроликів, індукованих ВЧЧ
Характеристики уражень артерій досліджували за допомогою патологічного зрізу ВІН-фарбування за допомогою світлової мікроскопії. У контрольній групі стінки судин були круглими з рівномірною товщиною. Внутрішня та зовнішня еластичні пластини були чіткими та повноцінними. Ядро клітини ендотелію було забарвлене і рівномірно розташоване. Під ендотелієм не було виявлено СМК (рис. 1 (а)).