Приготування зразка вестерн-блот Abcam

Пов’язані

Препарати зразків вестерн-блот, включаючи буфери для лізису, лізат із культури клітин, лізат із тканин та визначення концентрації білка.

Зразок протоколу підготовки змісту

Буфери для лізису
Інгібітори протеази та фосфатази
Приготування лізату з клітинної культури
Приготування лізату з тканин
Визначення концентрації білка
Підготовка зразків до завантаження в гелі: денатуровані та нативні, зменшені та нередуковані

Буфери для лізису

Лізисні буфери відрізняються своєю здатністю солюбілізувати білки, при цьому ті, що містять додецилсульфат натрію (SDS) та інші іонні миючі засоби, вважаються найжорсткішими, а отже, найімовірніше, дають найвищий урожай.

Головним фактором при виборі буфера для лізису є розпізнавання обраного антитіла денатурованими зразками. Коли це не так, це буде зазначено в таблиці даних щодо антитіл, і слід використовувати буфери без миючого засобу або з відносно м’якими неіонними миючими засобами (NP-40, Triton X-100).
U

Розташування білка та вибір буфера лізису

Розташування білка	Рекомендований буфер
Ціла клітина	НП-40
Цитоплазматичний (розчинний)	Трис-HCl
Цитоплазматичний (пов'язаний з цитоскелетом)	Тріс-Тритон
Зв'язані мембраною	NP-40 або RIPA
Ядерна	RIPA або використовувати протокол ядерної фракції *
Мітохондрії	RIPA або використовувати протокол фракції мітохондрій *

* Білки, які знаходяться виключно або переважно в субклітинному місці, будуть більше збагачені лізатом субклітинної фракції порівняно з лізатами цілих клітин або тканин. Це може бути корисно при спробі отримати сигнал для слабо вираженого білка. Будь ласка, зверніться до наших окремих протоколів щодо фракціонування субклітин.
U

Рецепти буфера лізису:

150 мМ хлориду натрію
1,0% NP-40 (Triton X-100 можна замінити NP-40)
50 мМ Трис рН 8,0

Це популярний буфер для вивчення білків, які пов'язані з цитоплазмою або мембраною, або для екстрактів цілих клітин. Якщо існує занепокоєння з приводу того, що цікавий білок витягується не повністю з нерозчинного матеріалу або агрегатів, буфер RIPA може бути більш придатним, оскільки він містить іонні миючі засоби, які легше приведуть білки до розчину.

Буфер RIPA (буфер аналізу радіоімунопреципітації)

150 мМ хлориду натрію
1,0% NP-40 або Triton X-100
0,5% дезоксихолату натрію *
0,1% SDS (додецилсульфат натрію)
50 мМ Трис, рН 8,0

* Можна приготувати у вигляді 10% -ного вихідного розчину, який повинен бути захищений від світла.

RIPA-буфер корисний для екстрактів цілих клітин та мембранно-зв'язаних білків, і може бути кращим, ніж буфери NP-40 або Triton X-100, для вилучення ядерних білків. Це порушить взаємодію між білками та білками, і, отже, може бути проблематичним для імунопреципітацій та аналізів на випадок.

У випадках, коли важливо зберегти білково-білкові взаємодії або мінімізувати денатурацію, слід використовувати буфер без іонних миючих засобів (наприклад, SDS), а в ідеалі - без неіонних миючих засобів (наприклад, Triton X-100).

Лізис клітин безмиючим буфером досягається механічним зсувом, часто за допомогою гомогенізатора Даунсе або пропусканням клітин через наконечник шприца. У цих випадках достатньо простого буфера Тріс, але, як зазначено вище, буфери з миючими засобами необхідні для вивільнення білків, пов’язаних з мембраною або цитоскелетом.

Трис-Тритоновий буфер (білки цитоскелета)

10 мМ Трис, рН 7,4
100 мМ NaCl
1 мМ ЕДТА
1 мМ EGTA
1% Тритон Х-100
10% гліцерин
0,1% SDS
0,5% дезоксихолату

Всі ці чотири буфери зберігатимуть при 4 ° C протягом декількох тижнів або до року, якщо розділити їх на аликвоти та зберігати при -20 ° C.

Інгібітори протеази та фосфатази

Як тільки відбувається лізис, починається протеоліз, дефосфорилювання та денатурація. Ці події можна значно уповільнити, якщо зразки постійно зберігаються на льоду або при температурі 4 ° C, а відповідні інгібітори додаються свіжими до буфера лізису.

Готові до використання коктейлі з інгібіторів від різних постачальників, але ви можете приготувати свій коктейль самостійно.

Інгібітор	Протеаза / фосфатаза загальмований	Кінцева концентрація в буфері для лізису	Запас (зберігати при -20 ° C)
Апротинін	Трипсин, хімотрипсин, плазмін	2 мкг/мл	Розвести у воді, 10 мг/мл. Не використовуйте повторно розморожені аліквоти.
Лейпептин	Лізосомальна	5–10 мкг/мл	Розвести у воді. Не використовуйте повторно розморожені аліквоти.
Пепстатин А	Аспарагінові протеази	1 мкг/мл	Розвести в метанолі, 1 мМ.
PMSF	Серин, протеїнази цистеїну	1 мМ	Розвести в етанолі. Ви можете повторно використовувати ту ж аликвоту.
ЕДТА	Металопротеази, яким потрібні Mg 2+ та Mn 2+	5 мМ	Розведіть у dH20, 0,5 М. Доведіть pH до 8,0.
EGTA	Металопротеази, які потребують Ca 2+	1 мМ	Розведіть у dH20, 0,5 М. Доведіть pH до 8,0
Фторид натрію	Серин/треонін фосфатази	5–10 мМ	Розвести у воді. Не використовуйте повторно після розморожування.
Натрію ортованадат	Тирозин фосфатази	1 мМ	Розвести у воді. Не використовуйте повторно після розморожування.