Простий метод визначення випаровування та компенсації втрат рідини в дрібномасштабній комірці

Вінсент Вігманн

1 Поглиблений центр біохімічної інженерії, Департамент біохімічної інженерії, Університетський коледж Лондона, Торрінгтон-Плейс, Лондон, WC1E 7JE UK

Крістіна Берналь Мартінес

2 Applikon-Biotechnology BV, Heertjeslaan 2, 2629 JG Delft, Нідерланди

Френк Баганц

Анотація

Завдання

Встановити метод непрямого вимірювання випаровування в системах культури клітин на основі мікрозвернень та показати, що запропонований метод дозволяє компенсувати втрати рідини в періодичних процесах подачі.

Результати

Виявлено кореляцію між випаровуванням та концентрацією Na + (R 2 = 0,95) при використанні мініатюрної системи біореакторів на основі 24 лунок (мікро-матриця) для періодичної культури з GS-CHO. На основі цих результатів було розроблено метод протидії випаровуванню з періодичними додаваннями води на основі вимірювань концентрації Na +. Впровадження цього методу призвело до зменшення відносних втрат рідини через 15 днів вирощування з періодичною подачею періодично з 36,7 ± 6,7% без об'ємних поправок до 6,9 ± 6,5% з об'ємними поправками.

Висновок

Була встановлена процедура побічного вимірювання випаровування за допомогою кореляції з рівнем іонів Na + у розчині та виведення простої формули для обліку втрат рідини.

Вступ

Біотехнологічні процеси зазвичай протікають при підвищеній температурі, і, як результат, повітря в системі, як правило, має високу вологість, що, в свою чергу, може призвести до високого вмісту рідини у відхідних газах. У міру того, як пара виходить із системи через газовідвід, об’єм заповнення культиваційного судини поступово зменшуватиметься. Ці зміни обсягу не тільки безпосередньо впливають на умови роботи, випаровування може також негативно впливати на процес через концентраційні ефекти та високий осмотичний тиск, що призводить до обмежень у рості клітин (Silk et al. 2010; Bareither and Pollard 2011; Lattermann and Büchs 2016 ).

Незважаючи на те, що закриття свердловин зменшує випаровування, невідповідність швидкостей випаровування залишається проблемою для систем з аеруванням, зокрема мікробіореакторів, де нерівномірний тиск газу призводить до розбіжностей у швидкості випаровування (Chen et al. 2009). У цих системах швидкість випаровування регулюється швидкістю потоку газу, на яку в свою чергу можуть впливати умови культури. Особливо під час тривалих експериментів з культурою клітин стає необхідним компенсувати випаровувану рідину шляхом періодичного додавання стерильної дистильованої води, щоб забезпечити постійні умови протягом усього експерименту. У форматах на основі мікропланшетів, випаровування на лунку зазвичай визначають із загальної втрати ваги пластини (Betts et al., 2014). Однак цей метод передбачає, що швидкість випаровування однакова у всіх свердловинах, що потенційно може призвести до сильно мінливих робочих обсягів та умов культивування. Вимірювання концентраційного ефекту одного або декількох компонентів середовища може бути використано як життєздатну альтернативу, яка менш інвазивна і легко проводиться поряд з аналізом зразка.

У цій роботі проводиться оцінка придатності трьох потенційних електролітів для використання в якості маркерів випаровування та пропонується недорогий метод опосередкованого вимірювання випаровування в дрібних компартментах клітинних культур. Цей новий метод продемонстровано в рамках зразкового експерименту з періодичною подачею з клітинами СНО, вирощеними в мікробіореакторі micro-Matrix.

Матеріали і методи

Докультура

Флакони IgG, що експресують промислову клітинну лінію GS-CHO (Лонза, Великобританія), розморожували і розбавляли 49 мл підігрітого CD-CHO (Life-Technologies, Великобританія), що містить 25 мкМ MSX. Потім клітини розширювали протягом 7 днів у струшувальній колбі з вентиляційним ковпачком (номінальний об’єм 250 мл, Corning Life Sciences, США), встановленому на орбітальному шейкері (Сарторіус, Великобританія) при 37 ° C, 5% СО2 та 70% вологість.

мікро-матриця

Мікро-матриця (Applikon-Biotechnology B.V, Нідерланди) - це мікробіореакторна платформа, яка дозволяє проводити 24 паралельних культивації з індивідуальним контролем рН, розчиненого кисню (DO) та температури. Культивування проводять в одноразовій 24-лунковій касеті з оптимальним робочим об'ємом від 2 до 5 мл.

процедура мікрокулькової клітини культури

Значення зміщення для калібрування зонда рН визначали заповненням кожної лунки касети micro-Matrix 2 мл 1 × PBS (Life-Technologies, Великобританія) та встановленням касети на систему micro-Matrix. Потім зонди залишали для рівноваги без будь-якого струшування або подальшого додавання газів. Через 1 год з кожної лунки витягували по 1 мл і вимірювали рН за допомогою автономного рН-метра (Mettler Toledo, Швейцарія). Потім значення зміщення коригувались таким чином, щоб вимірювання в режимі он-лайн відповідали значенням у режимі офлайн.

Суспензію з кінцевою концентрацією 3 × 105 життєздатних клітин мл -1 готували із застосуванням відповідної кількості середовища CD-CHO. 3,5 мл цієї суспензії заповнювали в кожну лунку касети з квадратною ямою площею 24 глибини (Аплікон, Нідерланди). Касета micro-Matrix була покрита верхньою пластиною, підключена до ліній подачі газу, а потім затиснута на оптичному тепловому модулі (OTM) мікро-матриці. Встановлені значення задавали при pH 7,2, 30% DO та 37 ° C. Зниження рівня рН було досягнуто з додаванням CO2; DO контролювали за допомогою додавання O2 та N2. Швидкість струшування встановлювалася як 220, так і 250 об/хв. PH і DO вимірювали через 10 с з використанням оптичних датчиків, розташованих на дні кожної лунки. Температуру свердловини контролювали для кожної свердловини за допомогою елементів Пельтьє, також розташованих на дні кожної свердловини.

Протокол пакетної подачі

Підживлення розпочали на 3 день вирощування, а потім повторювали кожні два дні. Болюсні добавки Efficient Feed B (Life-Technologies, Великобританія) були встановлені на рівні 10% об./Об. Від початкового робочого обсягу. Крім того, суспензію клітин додавали бікарбонатним буфером (250 мМ Na2HCO3 та 250 мМ NaH2CO3), встановленому на рівні 2,5% об./Об. формування.

Відбір проб та аналіз

Для періодичної культури три лунки відбивали в кожен пробний день. Клітинна суспензія всередині цих лунок була повністю видалена і зважена для того, щоб визначити об'ємні втрати внаслідок випаровування. Всі параметри, що залежать від об'єму, були виправлені на втрату об'єму. У випадку з періодичною культурою з кожної лунки відбирали обсяги проб від 350 до 500 мкл під час відбору проб. Точний обсяг залежить від аналізів, які проводяться в певний день (табл. 1). Концентрацію клітин визначали за допомогою Vi-CELL XR (Beckman Coulter, Великобританія), а залишок клітинної суспензії центрифугували при 1000 × g протягом 5 хв. Аналізатор Bioprofile FLEX (Nova Biomedical, США) був використаний для визначення рівнів усіх відповідних поживних речовин, метаболітів та електролітів. Кількісне визначення IgG4 проводили з використанням високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) Agilent 1200 (Agilent Technologies, UK) з колоною HP HP 1 мл HiTrap Protein G (GE Healthcare, Великобританія).