Протеомічне порівняння за допомогою iTRAQ у поєднанні з мас-спектрометрією білків яєчного білка у несучок

Ролі Концептуалізація, курація даних, формальний аналіз, методологія, програмне забезпечення, перевірка, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Поточна адреса: Університет Сичуань, Ченду, Сичуань, Китай

Ключова лабораторія прикордонної біотехнології Міністерства сільського господарства, Науково-дослідний інститут кормів, Китайська академія сільськогосподарських наук, Пекін, Китай

Ролі Курація даних, Формальний аналіз, Методологія

Ролі Збір даних, Програмне забезпечення

Розслідування ролей, адміністрування проектів, нагляд

Ролі Формальний аналіз, розслідування

Ролі Концептуалізація, методологія, адміністрування проектів, нагляд, написання - огляд та редагування

Дао Хе,
Хайджун Чжан,
Цзін Ван,
Шугенг Ву,
Хунюань Юе,
Гуанхай Ци

Цифри

Анотація

Бавовняне борошно (CSM) зазвичай використовується в раціоні курей для заміни соєвого шроту (SBM). Однак молекулярні наслідки цієї заміни залишаються незрозумілими. Щоб дослідити вплив цієї заміни на молекулярному рівні, iTRAQ у поєднанні з біохімічним аналізом проводили у курей Hy-Line W-36, доповнених змішаною дієтою CSM та SBM. Вага яєць, висота білка та одиниця Хау були значно зменшені в групі CSM100 (100% сирого білка SBM замінено CSM) порівняно з групою SBM (P Таблиця 1. Склад і рівні поживних речовин у раціонах курей-несучок з 40 до 51 тижнів віку.

Продуктивність, якість білків та колекція зразків

Параметри продуктивності та якості білка оцінювали під час випробування на годування 40–51 тижнів. Середня маса тіла несучок становила 1,76 ± 0,2 кг на початку випробування. Споживання корму та коефіцієнт конверсії корму (FCR, корм/яйце, г/г) вимірювали кожні два тижні, а продуктивність яєць, вага і смертність яєць реєстрували щодня.

В кінці випробування годування з кожної копії було зібрано п’ять яєць для визначення показників якості білка. Висоту білка та HU визначали за допомогою аналізатора яєць (ORKA Food Technology Ltd, Рамат Хашарон, Ізраїль). Всі результати були отримані при кімнатній температурі.

В кінці 51-го тижня випадково відбирали по одній несучці з кожної копії. Кров відбирали через крилову вену та центрифугували при 3000 × g протягом 10 хв для збору сироватки, яку потім зберігали при –20 ° C до аналізу. Шари негайно приносили в жертву шляхом вивиху шийки матки. Магнат яйцепроводу вирізали і зафіксували у 10% забуференному нейтральному формаліні (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd., Пекін, Китай) відповідно.

Оцінка морфології великого яйцепроводу та аналіз гормонів

Для гістопатологічних досліджень зразки яйцепроводу, закріплені формаліном (магнум), фарбували гематоксиліном та еозином (ВІН). Всі використовувані реагенти були аналітичного класу (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd., Пекін, Китай). Гістопатологічні зміни досліджували за допомогою світлового мікроскопа (BX51, Olympus Corp., Токіо, Японія). Гістопатологічну оцінку проводив кваліфікований персонал кафедри ветеринарної патології Пекінського сільськогосподарського університету. Концентрацію прогестерону та естрогену в плазмі крові аналізували за допомогою йоду [125I] естрадіолу та набору прогестеронових радіоімуноаналізів (Пекінський північний інститут біологічних технологій, Пекін, Китай).

Перетравлення трипсину та маркування iTRAQ

Аналіз за допомогою Q-Exactive мас-спектрометра та обробка даних

Інтерпретація та кількісне визначення даних

Для обробки даних ми використовували програмне забезпечення Proteome Discoverer 1.2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) для інтерпретації файлів необроблених даних, отриманих за допомогою мас-спектрометрії. База даних білка CHICK була завантажена з бази даних NCBI та поєднана із зворотними послідовностями та послідовностями широко розповсюджених забруднень, таких як кератини людини. Параметри пошуку в базі даних були наступними: трипсином було обрано фермент; два пропущені розщеплення були дозволені максимум; толерантність маси попередника була встановлена на 15 ppm; допуск маси фрагмента встановлено 20 мму; карбамідометилювання цистеїну було встановлено як фіксовану модифікацію; окислення метіоніну та мітки iTRAQ 4plex на N-кінцях та на бічних ланцюгах лізину були дозволені як динамічна модифікація. Був застосований суворий принцип максимального парсимонізму, і лише збіги пептидного спектру (PSM) з високою або середньою достовірністю та з дельта-Cn, що перевищувала 0,15, розглядалися для групування білків. Піки іонів інтегрували на основі найбільш впевненого центроїда з допуском 20 ppm. За допомогою зворотної бази даних коефіцієнт помилкового виявлення був встановлений на 0,01, щоб отримати високий рівень достовірності.

Кількісну оцінку білка проводили також за допомогою програми 1.2 Proteome Discoverer, яка автоматично обчислювала відносну кількість мічених iTRAQ пептидів та відповідних білків. Для кількісного визначення враховувались лише унікальні та високо впевнені пептиди. Для виправлення упередженості піпетування або визначення концентрації білка у змішаних зразках всі співвідношення білків нормалізували на середнє співвідношення білка. Мінімально значущі порогові значення регулювання становили 1,2. Білки із співвідношенням ≥1,2 або ≤0,833 розглядаються як диференційовано експресовані білки.

Вестерн-блот

Концентрацію білка супернатанту вимірювали за допомогою протеїнового аналізу Бредфорда. Зразки, що містять 30 мкг загального білка, розділяли 12% (мас./Об.) SDS-PAGE і переносили на мембрану PVDF (Millipore, Bedford, MA). Після інкубації протягом 1 години з блокуючим буфером (5% (мас./Об.) Нежирного молока в TBS-T (0,05% (об./Об.) Твін 20 у сольовому розчині, забуференному Tris), мембрану досліджували із зазначеними первинними антитілами, розведеними в блокуючий буфер протягом ночі при 4 ° С. Після ретельного промивання TBS-T мембрану інкубували з кон'югованим з пероксидазою хрону антитілом до кролика (Cell Signaling Technology), розведеним у блокувальному буфері (1: 2000), протягом 1 год при кімнатній температурі. Смуги візуалізували за допомогою хемілюмінесцентної підкладки Super Signal West Pico (Пірс) та записували на рентгенівські плівки (Fuji Medical, Токіо, Японія) .Нарешті, візуалізовані смуги кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення QUANTITY ONE на денситометрі GS-800 (Bio-Rad Антитіла, включаючи анти-овоінгібітор (ab193507), анти-лізоцим (ab391) та анти-авідин (ab6675), були придбані у компанії Abcam (Кембридж, Массачусетс, США).