Раннє старіння та вікові патології у мишей з дефіцитом BMAL1, основним компонентом

Роман В. Кондратов

1 Відділ біології раку, Науково-дослідний інститут Лернера, Фонд клініки Клівленда, Клівленд, штат Огайо, 44195, США;

Кондратова Анна Олександрівна

2 Відділ молекулярної генетики, Науково-дослідний інститут Лернера, Клінічний фонд Клівленда, Клівленд, Огайо 44195, США

Вікторія Юрійовна Горбачова

Олена Василівна Вихованець

1 Відділ біології раку, Науково-дослідний інститут Лернера, Клінічний фонд Клівленда, Клівленд, Огайо 44195, США;

Марина П. Антох

Анотація

Миші з дефіцитом циркадного фактора транскрипції BMAL1 (ARNT-подібний білок головного мозку та м’язів) мають порушення циркадної поведінки та демонструють втрату ритмічності в експресії генів-мішеней. Тут ми повідомляємо, що миші Bmal1 -/- зменшують тривалість життя і демонструють різні симптоми передчасного старіння, включаючи саркопенію, катаракту, менше підшкірного жиру, усадку органів та інші. Фенотип раннього старіння корелює із підвищеним рівнем активних форм кисню в деяких тканинах тварин Bmal1 -/-. Ці висновки, разом із даними щодо CLOCK/BMAL1-залежного контролю стресових реакцій, можуть надати механістичне пояснення раннього виникнення вікових патологій за відсутності BMAL1.

Результати і обговорення

Оскільки генетичний фон помітно впливає на фенотип даної одногенової мутації у мишей, для вирішення ролі BMAL1 у нормальній фізіології ми спочатку перенесли мутацію до штаму миші C56BL/6J (12 поколінь із зворотним кросом). Через безпліддя мутантів колонія Bmal1 -/- підтримувалась шляхом розведення гетерозиготних тварин, які дали потомство всіх трьох генотипів із очікуваним співвідношенням. Тварини KO та їх однолітки дикого типу спостерігали протягом усього життя на предмет розвитку всіх видів патологічних змін.

Тривалість життя тварин KO значно зменшилась у порівнянні з однолітками дикого типу (рис. (Рис. 1А). 1А). Більшість мутантів померли у віці від 26 до 52 тижнів (середня тривалість життя 37,0 ± 12,1 тижнів), тоді як жодна з мишей дикого типу та гетерозиготних не померла протягом періоду дослідження (52 тижні). Середня тривалість життя тварин C57BL/6J перевищує 2 роки (Nadon 2006); більш ніж удвічі довший, ніж той, що спостерігається для тварин KO. Найдовше живий мутант помер у віці 72 тижнів, що приблизно вдвічі коротше максимальної тривалості життя у цього штаму. Залежних від статі різниць у смертності не спостерігалося.

Передчасне старіння та рання смерть у мишей Bmal1 KO. (А) Крива виживання Каплана-Мейєра. (Замкнені кола) Миші дикого типу (WT); (відкриті кола) миші KO. Тварин дикого типу старше 1 року приносили в жертву. (B) Вікові зміни маси тіла чоловіків дикого типу (WT) та KO. (Замкнені кола) Миші дикого типу; (відкриті кола) KO миші. (C) Валовий вигляд 1-річних мишей дикого типу (WT) (праворуч) та KO (ліворуч). (D) Вага основних органів мишей, яким було 40 тижнів. (Чорні смуги) Дикий тип (WT); (сірі смуги) КО. Всі органи тварин КО, за винятком печінки, значно менші, ніж дикого типу (р -/- тварини. Фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) поперечних зрізів чотириголового м’яза стегна у 10- та 40-тижневих тварин обидва генотипи. (F) Диференціала лейкоцитів у молодих (10-тижневих) та вікових (40-тижневих) тварин дикого типу (WT) та KO. Кожна стопка в барі відображає відсоток типу клітин. (Neutr) Нейтрофіли; (Лімфа) лімфоцити; (Моно) моноцити; (Eos) еозинофіли; (Базо) базофіли; (LUC) великі незабарвлені клітини. У вікових мишей KO відсоток лімфоцитів зменшується, а відсоток моноцитів/нейтрофілів збільшується.

При народженні тварини KO не мають жодних видимих дефектів і їх неможливо відрізнити від диких типів послідів. Однак у віці 16–18 тижнів (для самців та жінок відповідно) миші Bmal1 -/- починають спостерігати затримку росту, про що свідчить знижена маса тіла. У той час як вага тварин дикого типу постійно зростала протягом 52 тижнів дослідження, вага мутантів перестала збільшуватися у віці 16-26 тижнів, а потім почала зменшуватися (рис. (Б); 1В; Додатковий рис. 1). Як результат, 52-тижневі миші KO мають приблизно половину розміру мишей дикого типу (рис. (Рис. 1C 1C).

Щоб дослідити причину втрати маси тіла, яка спостерігається у тварин KO, ми виміряли масу основних органів та тканин у 10-, 30- та 40-тижневих тварин обох генотипів. У віці 10 тижнів усі основні органи мишей дикого типу та КО були еквівалентними за розміром, за винятком насінних бульбашок, які були меншими у тварин Bmal1 -/-. Це зменшення, яке стає більш вираженим з віком, швидше за все, відображає дефект статевого дозрівання у мишей KO, що призводить до чоловічого безпліддя.

Встановлено, що відмінності у загальній масі тіла 40-тижневих тварин дикого типу та KO носять головним чином вплив на зменшення маси жирової та м’язової тканин у мишей KO (рис. (Рис. 1D). 1D). Середня маса внутрішньочеревної жирової тканини становила 1,5 г у чоловіків дикого типу віком 40 тижнів, але лише 70 мг у вікових та статевих КО. Підшкірно-жировий шар також значно зменшився у мутантів (рис. (Рис. 2). 2). Цей фенотип надзвичайно контрастує зі схильністю до ожиріння, що спостерігається у мишей-мутантів Clock/Clock (Turek et al. 2005). Існує кілька можливих пояснень цих контрастних фенотипів. Транскрипційний комплекс CLOCK/BMAL1 не може утворитися в клітинах з дефіцитом Bmal1, тоді як у клітинах Clock/Clock мутантний білок CLOCK зберігає здатність димеризуватися з BMAL1. Як нещодавно повідомлялося, комплекс CLOCK/BMAL1 проявляє подвійну функціональну активність, працюючи як активатор транскрипції, так і репресор транскрипції, залежно від його взаємодії з CRY. Як наслідок, обидві функції комплексу втрачаються в Bmal1-дефіцитних клітинах, тоді як у мутантних клітинах Clock порушується лише трансактивація (Kondratov et al. 2006b). В якості альтернативи спостережувані фенотипові відмінності між мишами Bmal1 -/- та Clock/Clock можна пояснити взаємодією CLOCK та BMAL1 з різними функціональними партнерами.

Вікові патології шкіри у мишей KO. (A) Відростання спинного волосся через 1 місяць після гоління спостерігали у мишей дикого типу (WT) (ліворуч), але не KO (праворуч). (B) Фарбування H&E поперечних зрізів шкіри у 10-тижневих мишей дикого типу (WT) та KO не виявляє жодних морфологічних відмінностей між генотипами. (SAT) Підшкірна жирова тканина. (C) Фарбування H&E поперечних зрізів шкіри демонструє різке зниження рівня SAT у 40-тижневих мишей KO.

Сорокатижневі тварини Bmal1 -/- також демонструють вікове зменшення м’язової та кісткової маси (рис. (Рис. 1D). 1D). Обидва явища (саркопенія старіння та остеопороз) є ознаками старіння ссавців (Weiss et al. 1991; Karakelides and Sreekumaran Nair 2005). Гістологічне дослідження поперечних зрізів чотириголового м’яза стегна показало, що зменшена м’язова маса у тварин КО пов’язана зі зменшенням кількості м’язових волокон та їх діаметру. Цей дефект залежить від віку, оскільки 10-тижневі тварини не виявляють ніяких відмінностей у структурі м’язових волокон між генотипами (рис. (Рис. 1E 1E).

На додаток до жиру, м’язів та кісток, маса кількох основних органів (селезінки, нирок, яєчок, серця та легенів) значно зменшилась у 40-тижневих тварин KO (рис. 1D). 1D ). Водночас між генотипами не було відмінностей у розмірі шлунка, печінки чи кишечника. У віці 30 тижнів у КО лише селезінка була значно меншою порівняно з тваринами дикого типу (Додаткова Рис. 2). Усі інші органи знаходились лише на нижній межі норми нормальної ваги. Гістологічне дослідження KO селезінки та нирок не виявило жодних дегенеративних уражень (дані не наведені), що дозволяє припустити, що їх менший розмір не обумовлений гострим дегенеративним процесом, а скоріше наслідком систематичного зменшення. Вікове зменшення селезінки, нирок і яєчок спостерігалося під час природного старіння, а також на тваринних моделях прискореного старіння (Arking 1998; Tyner et al. 2002).