Ретинопатія у дієтологічних моделях діабетичних щурів типу 2 та роль епігенетичних модифікацій
Анотація
Вступ
Поширеність діабету у всьому світі зростає швидкими темпами, і серед населення, що страждає на діабет, на діабет 2 типу доводиться 90% всіх випадків у всьому світі. Фізична бездіяльність, споживання трансжирів та ожиріння вважаються головним фактором зростання діабету (1,2). Швидке збільшення захворюваності на діабет також посилює загальний тягар діабетичних ускладнень, включаючи втрату зору через діабетичну ретинопатію (3), а експериментальні моделі є ключем до розуміння молекулярних механізмів терапевтичних втручань.
Діабетичне середовище посилює окислювальний стрес, і вважається, що окислювальний стрес відіграє важливу роль у розвитку діабетичної ретинопатії (12–14). При цукровому діабеті мітохондрії сітківки пошкоджені, а пошкодження ДНК більш масштабні у ділянці петлі витіснення (D-Loop) мтДНК, областях, важливих для транскрипції та реплікації мтДНК. Крім того, експресія багатьох генів сітківки та білків, пов'язаних з гомеостазом мітохондрій, змінена (14,15). Експериментальні моделі задокументували, що збільшення кількості цитозольних реактивних форм кисню (АФК) передує мітохондріальній дисфункції (16), а НАДФН-оксидаза 2 (Nox2) є одним з основних ферментів, пов'язаних з виробленням цитозольної АФК. Rac1, маломолекулярний G-білок, є обов’язковим компонентом голоферменту Nox2, і при діабетичній ретинопатії сигналізація Rac1-Nox2-ROS активується до пошкодження мітохондрій (17).
Недавні дослідження зафіксували, що ферментативний механізм, відповідальний за епігенетичні модифікації, модифікації, які можуть змінювати експресію гена, не впливаючи на послідовність ДНК, також змінюється при цукровому діабеті (14,15,18). Активуються ферменти, що відповідають за підтримання статусу метилювання ДНК, ДНК-метилтрансферази (Dnmts) і десять одинадцять транслокаційних метилцитозин діоксигеназ (Tets), і мтДНК гіперметилюється в сітківці та її судин у гризунів діабету 1 типу та донорів людини із задокументованою діабетичною ретинопатією (19). Однак, як ожиріння/гіперліпідемія впливає на метилювання ДНК та його ферментативні механізми в гіперглікемічному середовищі, незрозуміло.
Гіперглікемічна модель щурів з високим вмістом жиру та стрептозотоцином (Stz) зараз використовується для нервових ускладнень та фармакологічних скринінгів (20, 21), але розвиток діабетичної ретинопатії на цій тваринній моделі не з’ясовано. Нашою метою було дослідити розвиток діабетичної ретинопатії на цій моделі тварин із діабетом 2 типу, яка імітує нормальний розвиток та метаболічні особливості діабету 2 типу людини. Ми досліджували патологію судин сітківки та функціональні зміни на моделі щурів з високим вмістом жиру від 2 до 6 місяців після індукованої Stz гіперглікемії та порівнювали її з моделлю щурів діабету 1 типу. Щоб зрозуміти молекулярний механізм, оцінюють пошкодження мітохондрій та епігенетичні модифікації мтДНК та промотору Rac1 в мікрососудах сітківки на цих моделях тварин з діабетом.
Дизайн та методи дослідження
Самців щурів Sprague Dawley (віком від 9 до 10 тижнів) розділили на дві групи; в той час як щури в групі 1 залишались на звичайній щурячій чау (каталожний номер 7001; Envigo, штат Індіанаполіс, штат Індонезія), що містить 4,25% ккал у вигляді жиру, щурів групи 2 поміщали на дієту з високим вмістом жиру (номер каталогу D12451; Нью-Брансвік, Нью-Джерсі), що містить 45% ккал у вигляді жиру. Через 8 тижнів на дієті з високим вмістом жиру половина щурів отримувала низьку дозу Stz (30 мг/кг маси тіла [BW] i.p.) для індукування діабету (T2D) (21,22). Одночасно половині щурів, які отримували регулярний чау-щур (група 1), також вводили 60 мг/кг БТ Stz (T1D) (16), а інша половина залишалася нормальним контролем (Норма); у кожній групі було 12–16 щурів. Протягом усього експерименту щури в групах T2D та HF підтримувались на одній і тій же дієті з високим вмістом жиру, а групи T1D та Norm - на нормальній чау-щурі. Їх приносили в жертву через 2, 4 і 6 місяців після введення Stz. Поводження з тваринами відповідало вимогам Асоціації дослідників зору та офтальмології щодо використання тварин у офтальмологічних та зорових дослідженнях та відповідало нашим інституційним рекомендаціям.
Толерантність до глюкози та резистентність до інсуліну
Щурів голодували протягом ночі, зважували і вводили глюкозу (2 г/кг т. Д. Внутрішньовенно). Глюкозу в крові вимірювали за допомогою смужок реагентів глюкозо-оксидази безпосередньо перед і через 15–180 хв після введення глюкози (22).
Чутливість до інсулінорезистентності визначали шляхом введення препарату Гумулін R (1 МО/кг перорального в/в) (Eli Lilly and Company, Індіанаполіс, штат Індонезія) та вимірювання рівня глюкози в крові через 0–180 хв після введення інсуліну (23).
Ліпідний профіль сироватки
Кількісно визначали рівень холестерину та тригліцеридів у сироватці крові за допомогою комерційних наборів від Abcam (каталожні номери ab65390 та ab65336; Cambridge, MA), як описано раніше (8).