РН сперми впливає на рухливість та ємність сперми

Цзі Чжоу

1 Центр репродуктивної медицини, лікарня Цзіньлін, клінічна школа медичного коледжу, Нанкінський університет, Нанкін, Китайська Народна Республіка,

Лі Чень

Jie Li

2 Департамент нейрохірургії лікарні Цзіньлін, клінічна школа медичного коледжу, Нанкінський університет, Нанкін, Китайська Народна Республіка,

Хонджун Лі

3 Кафедра урології, лікарня Пекінського союзу медичного коледжу, Китайська академія медичних наук та Медичний коледж Пекінського союзу, Пекін, Китайська Народна Республіка,

Чживей Хонг

Мін Се

Шенгронг Чень

Бінг Яо

Задумав та спроектував експерименти: JZ BY. Виконував експерименти: JZ JL HJL. Проаналізовано дані: JZ JL HJL. Внесені реагенти/матеріали/інструменти для аналізу: ZWH MX SRC. Написав папір: JZ LC JL HJL BY.

Пов’язані дані

Усі відповідні дані містяться в роботі.

Анотація

Вступ

Згідно зі статистичними даними, приблизно кожна шоста пара безпліддя, з яких майже половина пояснюється чоловічими факторами [1]. Основні клінічні прояви чоловічого безпліддя включають зменшення кількості сперматозоїдів (олігозооспермія), зниження рухливості сперматозоїдів (астеноспермія) та морфологічні відхилення сперми (тератозооспермія) [2,3]. Понад 85% безплідних чоловіків насправді можуть виробляти сперму [4], але їх сперма часто не в змозі запліднювати яйцеклітину.

Деякі повідомлення про клінічні випадки вказують на те, що рН сперми чоловічої астеноспермії міг змінитися [11,25]. Однак чи впливає і як рН сперми на рух сперми та її ємність, залишається незрозумілим. Розуміння впливу рН насінної плазми може бути корисним для клінічного лікування безпліддя. Тому ми досліджували зміни рухливості та життєздатності сперми у біологічно значущому діапазоні рН та вимірювали відповідну активність Na +/K + -ATPase та внутрішньоклітинні зміни Ca 2+ сперматозоїдів.

Матеріали і методи

Збір сперми

Це дослідження було схвалено Комітетом з етики лікарні Нанкін Цзіньлінь відповідно до національних та міжнародних рекомендацій. У цьому дослідженні брали участь 136 добровольців чоловічої статі, середній вік яких становив 27,54 ± 3,98 (середнє ± стандартне відхилення). Перед початком дослідження від усіх учасників було отримано письмову інформовану згоду. Сперма, яку піддавали аналізу, була взята від здорових чоловіків-добровольців. Відповідно до критеріїв Всесвітньої організації охорони здоров’я (2010) у цих чоловіків була доведена фертильність та нормальна якість сперми. Зразки сперми отримували за допомогою мастурбації після принаймні 3 днів утримання.

Зразки еякулювали у стерильні контейнери та давали їм зріджуватися принаймні 30 хв, перш ніж обробляти центрифугуванням у градієнті Percoll 60% (GE Healthcare, Waukesha, WI, США) для видалення насінної плазми, незрілих статевих клітин та не сперматозоїдів клітини (переважно епітеліальні клітини), як описано Loredana-Gandini et al. [26,27]. Потім очищені сперми промивали в розчині для живлення сперми (NaCl 670,8 мг; KCl 35,6 мг; 147 мг/мл CaCl2 · 2H2O 171 мкл; KH2PO4 16,3 мг; MgSO4 · 7H2O 29,3 мг; NaHCO4 210,6 мг; D-глюкоза 100 мг; 60 % Na · лактату 0,37 мл; HEPES 238 мг; Penicllin 6 мг, розчинений у 100 мл стерильної води) 3 рази перед подальшим аналізом. У всіх наступних експериментах використовували очищену сперму, об’єднану з 3–4 добровольців, віднесених до чотирьох груп, і всі експерименти проводились принаймні у трьох повторностях.

Оцінка рухливості сперми

Очищені сперми ресуспендували в живильному розчині сперми рН 5,2, 6,2, 7,2 та 8,2 та інкубували відповідно 15, 30, 60, 90 та 120 хв. Для оцінки рухливості сперми використовували комп’ютерний аналіз сперми (CASA; WLJY-9000; Weili New Century Technology Development Co., Ltd; Пекін; Китай). Непрогресуюча моторика (NP, всі інші моделі моторики з відсутністю прогресування), прогресуюча моторика (PR, сперматозоїди, які рухаються активно, лінійно або по великому колу, незалежно від швидкості), рухливість (PR + NP), середній шлях швидкість (VAP, швидкість по розрахованому згладженому шляху), криволінійна швидкість (VCL, швидкість над фактичною доріжкою сперми, включаючи всі відхилення руху голови сперми), швидкість прямої лінії (VSL, швидкість на прямій відстані між початком і початком кінець доріжки сперми) були розраховані для кожної групи з трьох записів щонайменше 100 сперми.

Тест HOS

Тест HOS використовували для оцінки життєздатності сперми. Сперму ресуспендували в живильному розчині сперми рН 5,2, 6,2, 7,2 та 8,2 відповідно протягом 60 хв і центрифугували при 760 г протягом 15 хв. Надосадову рідину відкидали, і осад змішували з 0,5 мл розчину набухання (0,735 г дигідрату цитрату натрію і 1,351 г D-фруктози, розчиненого в 100 мл очищеної води) з наступною інкубацією протягом 30 хв при 37 ° С. Після інкубації CASA дослідила понад 200 сперматозоїдів. Відповідно до критеріїв Всесвітньої організації охорони здоров’я (2010), кількість сперматозоїдів, що набрякли та не набрякли, була зафіксована відповідно [28].

Тест на вимірювач проникнення сперми (SPM)

Капіляри, повні розчину для живлення сперми з різним рН, перпендикулярно вставляли в пробірки, що містять 200 мкл сперматозоїду (очищена сперма людини в розчині для живлення сперми). Зверху капілярні піпетки та отвір пробірок закривали герметичною плівкою з наступною інкубацією протягом 1 години при 37 ° С. Відповідно до критеріїв Всесвітньої організації охорони здоров’я (2010), відстань руху сперми вимірювали під оптичним мікроскопом (CX31; OLYMPUS; Японія).

Аналіз Na +/K + -ATPase

Сперму (10 7) розбавляли 2 мл розчинів для живлення сперми при рН 5,2, 6,2, 7,2 та 8,2 відповідно, інтенсивно перемішували та інкубували протягом 60 хв при 37 ° С в 5% інкубаторі CO2. Пробірки центрифугували при 760 г протягом 15 хв для видалення живильного розчину, осад промивали звичайним сольовим розчином 3 рази та лізували ультразвуком (4 ° С, 40% енергії, обробляли ультразвуком протягом 5 с, зупиняли на 5 с, цикл 1 хв) (VCX750; Sonics; США). Концентрацію білка визначали за допомогою аналізу біцинхонінової кислоти (BCA) (продукт № 23225, Thermo, США). Активність Na +/K + -ATPase сперми вимірювали за допомогою набору для вимірювання Na +/K + -ATPase (Nanjing Jiancheng Bioengineering Inc.), і одиницю демонстрували як μmolPi/мг prot/година.