Розвантаження скелета стримує проліферацію in vitro і диференціювання остеопрогенітора щурів

Медичний центр управління ветеранів, Медичний факультет, Каліфорнійський університет, Сан-Франциско 94121; і

Національний центр управління аеронавтики та космосу - Еймс, Моффетт-Філд, Каліфорнія 94035

Медичний центр управління ветеранів, Медичний факультет, Каліфорнійський університет, Сан-Франциско 94121; і

Анотація

мікрогравітація, пов'язана з космічними польотами, призводить до дефіциту кісткової маси у людей та тварин (15, 18). У щурів остеопенічна реакція на мікрогравітацію пов'язана зі зменшенням кількості остеобластів, зменшенням формування кісток та затримкою дозрівання кісток (4, 15). Подібні зміни можуть бути викликані на задніх кінцівках щурів підняттям задніх кінцівок (3, 4, 6, 7, 27). Хоча остеобласт, як видається, є головним посередником остеопенії в цих моделях, основний механізм пригнічення остеобластів незрозумілий. Розвантаження скелета може зменшити кількість остеопрогеніторних клітин або інгібувати їх проліферацію, як передбачається зменшенням кількості остеобластів у ненавантаженій кістці (7) та зменшенням проліферації культивованих остеобластів, виділених із нерозвантажених кісток (12, 27). Диференціація остеобластів також може бути пригнічена, як це передбачається пригніченням мінералізації та дозрівання ненавантаженої кістки (3, 6) та зміненою експресією генів, пов'язаних з диференціацією остеобластів у ненавантаженій кістці (4).

Протоколи тварин та обробка тканин.

Окремий експеримент був проведений для вивчення ефектів підняття задніх кінцівок на проліферацію BMSC та активність АР. Щури були підняті на задні кінцівки протягом 0 або 5 днів ( = 12/групу), а їх клітини великогомілкового мозку видаляли та об'єднували, утворюючи чотири незалежні пули клітин на групу, кожна з яких включала лівий та правий клітини великогомілкового мозку від трьох тварин. Клітини культивували в шестилункових планшетах, як описано нижче, протягом 28 днів для вивчення часового курсу проліферації та активності ферменту AP.

Методи клітинної культури.

Ізоляція РНК.

Через 10, 15, 20 і 28 днів культури загальну РНК виділяли з кожного пулу великогомілкової клітини за допомогою набору РНК Stat-60 (TelTest, Friendswood, TX). РНК розводили у воді, обробленій діетилпірокарбонатом, і концентрацію та чистоту оцінювали за допомогою спектрофотометра Uvikon (Research Instruments International, Сан-Дієго, Каліфорнія). РНК електрофорезували на 1% агарозному гелі SeaKem (FMC Bioproducts, Rockland, ME), що містить бромід етидію, і візуалізували під ультрафіолетовим (УФ) світлом для підтвердження її цілісності. Двадцять мікрограмів загальної РНК з кожного пулу були зворотно транскрибовані в кДНК за допомогою праймерів оліго (dT) та набору зворотної транскрипції GIBCO Superscript II (GIBCO).

Клонування шаблонів кДНК-конкурентів для QC-PCR.

QC-PCR.

Ген GAPDH використовували для контролю потенційних коливань ефективності зворотної транскрипції між різними пулами кДНК. Рівні GAPDH визначали в трьох примірниках для всіх пулів кДНК, а дані для c-fos, Потім експресія AP та гена остеокальцину нормалізувались до рівня GAPDH та виражали як нанограми на мікрограми GAPDH. Перед зворотною транскрипцією аликвоти РНК піддавали аналізу Норт-блот з використанням зонда GAPDH (дані не наведені). Цей аналіз продемонстрував, що на експресію гена GAPDH не впливали ні підняття задніх кінцівок, ні тривалість у культурі, і тому він був дійсним геном ведення домашнього господарства для контролю потенційних коливань ефективності зворотної транскрипції між 36 незалежними пулами кДНК.

Аналізи клітинної проліферації та активності АР.

Мінералізація in vitro.

Після 28-денного посіву 10-сантиметрові посуди, що містять стегнові BMSC, промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом, і фіксували на 1 год 10% формаліном. Після промивання закріплених культур дистильованою водою їх фарбували протягом 5 хв 1% червоним алізарином у 2% етанолі, щоб виявити мінерал. Потім культури п’ять разів промивали дистильованою водою для видалення слабо зв’язаних плям. Отримані забарвлені бульбочки були занадто численні, щоб точно визначити кількісні показники, тому пляма солюбілізували протягом 30 хв при кімнатній температурі з 0,5 N HCl-5% додецилсульфатом натрію (SDS). Розчинену пляму видаляли з пластин, а поглинання вимірювали на спектрофотометрі при 415 нм. Для кожної тварини аналізували та усереднювали п’ять повторюваних 10-сантиметрових блюд, а середні значення для шести тварин усереднювали для кожної групи. Попередні експерименти продемонстрували, що поглинання лінійно пов'язане з кількістю елюйованого червоного азазарину в межах діапазону, виміряного в цих експериментах.

Статистичний аналіз.

Відмінності між піднятими на задні кінцівки та нормально навантаженими тваринами визначали за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) за допомогою SigmaStat (Jandel Scientific Software, Сан-Рафаель, Каліфорнія).

П'ять днів підняття задніх кінцівок призвели до значного зменшення маси жиру стегнової кістки (

Таблиця 1. Вплив підняття задніх кінцівок на масу тіла, масу безжирової кістки та концентрацію іонізованого кальцію в сироватці крові

Значення є середніми ± SE. HLE, підняття задніх кінцівок.

* Значно менше, ніж контроль (0 днів HLE) і 2 дні HLE, † Значно більше, ніж контроль,

Рис. 1.Вираз с-fos мРНК культивованими стромальними клітинами кісткового мозку (BMSC). Кількісна конкурентна ланцюгова реакція полімерази (QC-PCR) була використана для кількісного визначення c-fos Рівні мРНК у трьох примірниках для кожного пулу кДНК і стандартизовані до рівнів гліцеральдегідфосфатдегідрогенази (GAPDH) в тому ж пулі. Відкриті бари, елементи керування [0 днів підняття задніх кінцівок (HLE)]; сірі смуги, 2 дні HLE; і штрихувані бруски, 5 днів HLE. П'ятиденна група HLE значно менше, ніж 0-денна група HLE [двосторонній дисперсійний аналіз (ANOVA),

Експресія мРНК AP була значно підвищена в остеопрогеніторних клітинах, виділених у 5-денних щурів, піднятих на задні кінцівки, порівняно з контролем (рис.2). Більша частина цього підвищеного вираження проявлялась у ранні періоди часу в культурі (10 та 15 днів), а загальний приріст протягом періоду культури становив 61% порівняно з контролем (

Рис.2.Експресія мРНК лужної фосфатази (AP) за допомогою культивованих BMSC. QC-PCR використовували для кількісної оцінки рівнів мРНК AP у трьох примірниках для кожного пулу кДНК та стандартизували до рівнів GAPDH в тому ж пулі. Відкриті бари, елементи управління (0 днів HLE); сірі смуги, 2 дні HLE; і штрихувані бруски, 5 днів HLE. П'ятиденна група HLE значно перевищує 0-денну групу HLE (двостороння ANOVA,