Система включення-виключення для передачі сигналів PI3-кінази – Akt через S-нітрозилювання фосфатази з послідовністю

Відредаговано Соломоном Х. Снайдером, Медичний факультет Університету Джона Хопкінса, Балтимор, доктор медичних наук, та затверджено 17 травня 2011 р. (Отримано на огляд 4 березня 2011 р.)

сигналів

Анотація

Оксид азоту (NO) здійснює плейотропні клітинні реакції на проліферацію, апоптоз, нейромедіацію та нейротоксичність у декількох типах клітин за допомогою S-нітрозилювання білка. Ця модифікація відбувається за допомогою окислювальної реакції між NO та цистеїном (Cys) тіолом у присутності акцептора електрона (наприклад, O2 або перехідного металу) або шляхом трансітрозилювання з S-нітрозотіолу в інший цис-тіол (1–3). Опубліковано кілька методів виявлення S-нітрозильованих білків (SNO-Ps) за допомогою антитіл, фотолізу та спорідненості ртуті (4). Зокрема, аналіз перемикання біотину - це модифікований імуноблот, розроблений Джеффрі та Снайдером, який зазвичай використовується для виявлення ендогенних SNO-Ps; цей метод значно вдосконалив галузь (5). Згодом були розроблені інші методи виявлення SNO-Ps (6), але деякі з них включають зразки, оброблені високими концентраціями донора NO. Однак у присутності високих концентрацій NO може бути, що деякі залишки Cys артефактивно S-нітрозильовані.

Масиви антитіл використовувались для визначення рівня експресії білка з високою чутливістю. Кожне плямисте антитіло може бути перевірено на його здатність зв'язувати білки в аналізі. Зразки, що гібридизуються з кожним антитілом з масиву, можна легко виявити. Незважаючи на те, що за останні кілька років ряд білків були визначені як субстрати для S-нітрозилювання (3–6), ми висунули гіпотезу про те, що ще багато кандидатів, модифікованих фізіологічним рівнем NO, все ще можуть бути визначені. Тому ми перевірили, чи можна пристосувати масив антитіл для ідентифікації додаткових SNO-Ps та їх (пато) фізіологічних функцій.

У цьому дослідженні ми намагалися виділити SNO-Ps у фізіологічному стані за допомогою масиву антитіл. Ми підготували екстракти з клітин, оброблених або необроблених NO і спеціально мічених біотином. Ми виявили, що фосфатаза з гомологією послідовності до тензину (PTEN) переважно S-нітрозильована низькими концентраціями NO. Хоча інші повідомлення показали, що PTEN може піддаватися S-нітрозилюванню за високих концентрацій NO (7–13), тут ми виявили значення (пато) фізіологічної функції S-нітрозильованого PTEN (SNO-PTEN) на шляху Akt, використовуючи системи in vivo та in vitro. Наші результати свідчать про те, що пригнічення активності PTEN за допомогою S-нітрозилювання посилює передачу сигналу Akt, сприяючи тим самим виживанню клітин в ішемізованому мозку та активації ендотеліальної NO-синтази (eNOS).

Результати

Скринінг на S-нітрозильовані нервові білки.

Спочатку ми розробили унікальну скринінгову систему для виділення раніше не описаних SNO-Ps у нейрональних системах за допомогою масиву антитіл. Зразки готували з клітин нейробластоми SH-SY5Y людини, які зазнали впливу іонофору кальцію A23187, який активує ендогенну нейрональну NO-синтазу (nNOS) та eNOS для отримання фізіологічних концентрацій NO. Залишки S-нітрозильованого Cys у клітинних лізатах перетворювались у свою біотинільовану форму, використовуючи техніку перемикання біотину (5). Ці зразки, що містять біотинільовані цистеїни, піддавали масиву антитіл і виявляли інтенсивність флуоресценції (рис. S1). Було визначено двадцять п’ять кандидатів, включаючи відомі SNO-Ps, такі як каспаза, NOS та HDAC (таблиця S1; посилання 14–16). Серед інших кандидатів ми зупинились на впливі S-нітрозилювання на активність PTEN та його фізіологічні функції. PTEN є інгібуючим регулятором сигнального шляху PI3-кінази/Akt, тим самим послаблюючи ріст, міграцію та виживання клітин (17–21).

S-нітрозилювання ПТЕН.

Щоб перевірити S-нітрозилювання PTEN, ми дослідили, чи був PTEN суттєво S-нітрозильованим за низької концентрації фізіологічного донора NO-S-нітрозоцистеїну (SNOC). SNOC помітно підвищував рівень SNO-PTEN у клітинних лізатах та інтактних клітинах. SNO-PTEN не був виявлений в контрольних аналізах перемикання біотину, проведених без аскорбату для видалення NO, таким чином запобігаючи заміщенню NO біотином (рис. 1А). Як і слід було очікувати, PTEN був дуже чутливим до NO; Освіта SNO-PTEN було виявлено в 293 клітинах ембріональної нирки людини (HEK) після обробки 1–10 мкМ SNOC (рис. 1 B і C). Крім того, ця модифікація також була виявлена ​​в клітинах, що зазнали впливу інших інших типів донорів NO, включаючи S-нітрозо-глутатіон (GSNO) та 2- (N, N-діетиламіно) -діазенолат-2-оксид (DETA-NONOate; Рис. S2).

Далі, щоб дослідити, чи індукує ендогенно NO також індукує утворення SNO-PTEN, ми використовували клітини HEK, які стабільно експресують nNOS. PTEN був S-нітрозильований ендогенним NO у відповідь на A23187 чутливим до NOS-інгібіторів способом (рис. 1D та рис. S3). PTEN ссавців має у своєму домені фосфатази п’ять цистеїнів (17). Щоб визначити цільову ділянку S-нітрозилювання на PTEN, ми мутували кожен цистеїн до серину та аналізували утворення SNO-PTEN за допомогою методу перемикання біотину. Клітини HEK трансфікували експресійними векторами, що кодують або FLAG-PTEN дикого типу (WT), або мутантні форми білка. Через 24 год клітини піддавали дії SNOC або контролю та контролювали SNO-PTEN. Ми виявили, що мутант C83S PTEN майже не виробляв сигналу, припускаючи, що Cys-83 був переважним місцем S-нітрозилювання (рис. 1Е). Крім того, ми провели хімічний аналіз очищеного рекомбінантного PTEN для виявлення S-нітрозилювання за допомогою 2,3-діамінонафталену (DAN). DAN стехіометрично перетворюється на флуоресцентний 2,3-нафтилтриазол у присутності NO, що виділяється з S-нітрозотіолу. Оброблений SNOC PTEN привів до значного утворення SNO-P, тоді як мутант PTEN (C83S) був повністю позбавлений флуоресцентного сигналу (рис. S3).