Системне та судинне запалення в in vitro моделі центрального ожиріння
Арті Ахлувалія
1 Дослідницький центр Е. Піаджо, Пізанський університет, Піза, Італія
Алессандра Місто
2 Італійська національна наукова рада, Інститут клінічної фізіології, Піза, Італія
Федеріко Воцці
2 Італійська національна наукова рада, Інститут клінічної фізіології, Піза, Італія
К'яра Мальяро
1 Дослідницький центр Е. Піаджо, Пізанський університет, Піза, Італія
Джорджо Маттей
1 Дослідницький центр Е. Піаджо, Пізанський університет, Піза, Італія
Марія Крістіна Марескотті
3 Медичний факультет Падуанського університету, Падуя, Італія
Анджело Авогаро
3 Медичний факультет Падуанського університету, Падуя, Італія
Елізабетта Іорі
3 Медичний факультет Падуанського університету, Падуя, Італія
Пов’язані дані
Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.
Анотація
Порушення обміну речовин через надмірне харчування є головною глобальною проблемою здоров’я, часто пов’язаною з ожирінням та пов’язаними із нею захворюваннями. Ожиріння властиве людині, оскільки воно пов’язане із способом життя та харчуванням, і настільки важко відтворюється на тваринних моделях. Тут ми описуємо модель центрального ожиріння людини, засновану на 3-тканинній системі, що складається з ряду взаємопов’язаних текучих модулів. Враховуючи причинно-наслідковий зв’язок між ожирінням та системним запаленням, ми зосередились насамперед на прозапальних маркерах, вивчаючи подібність та відмінності між моделлю 3-тканин та свідченнями досліджень на людях у літературі. При застосуванні високого рівня ожиріння система in vitro виявляє серцево-судинний стрес через експресію Е-селектину та фактора фон Віллебранда, а також системне запалення (що експресує IL-6 та MCP-1), як це спостерігається у людей. Цікаво, що більшість відповідей залежать від синергічної взаємодії між ожирінням та наявністю декількох типів тканин. Набір може зменшити експерименти на тваринах при дослідженні ожиріння і може допомогти розкрити специфічні клітинні механізми, які лежать в основі реакції тканин на харчові перевантаження.
Вступ
Надмірна вага та ожиріння є основними факторами ризику ряду хронічних захворювань, включаючи діабет [1], серцево-судинні захворювання та рак [2]. З початку століть кількість дорослих з ожирінням зросла до понад 300 мільйонів. Люди з ожирінням часто мають надлишкове ожиріння в центральній частині вісцералу, стан, що сприяє хронічному збільшенню циркулюючих вільних жирних кислот та метаболітів, таких як гліцерин та тригліцериди. Ці метаболіти, у свою чергу, активують різні сигнальні каскади, які перешкоджають передачі сигналів інсуліну та функціонуванню β-клітин, додатково сприяючи глюко/ліпотоксичності [3].
Велика кількість досліджень була присвячена розмежуванню етіопатогенних механізмів ожиріння та діабету на тваринних моделях. Найбільш широко використовуваними моделями ожиріння є гризуни - миші-мутанти або генетично сконструйовані миші, або щури, у яких ожиріння викликається тривалим харчуванням дієтами з високим вмістом жиру [4,5]. Як коротко висловили Ванг та співавт., "Незважаючи на широке використання цих моделей гризунів, багато механістичні деталі метаболізму людини залишаються недостатньо зрозумілими, а варіанти лікування для людей обмежені та в основному незадовільні" [6]. Дійсно, ми зараз знаємо багато про подробиці метаболізму гризунів, але все ще не маємо детального розуміння механізмів, що лежать в основі гомеостазу глюкози людини та реакції на хронічне надмірне харчування, а також супутніх захворювань та реакцій на втручання, пов’язані з ожирінням людини [7].
Окрім очевидних відмінностей між тривалістю життя людини та гризунів, харчуванням та базовою біологією, тваринні моделі не піддаються дисоціації динаміки метаболітів у різних тканинах та органах. Як наслідок, виявлення внеску окремих тканин чи органів у баланс поживних речовин або дестабілізацію є грізним завданням. Деякі спроби були зроблені для моделювання ожиріння людини за допомогою методів in vitro, більшість із них стосуються жирових клітинних або тканинних культур, отриманих із клітинних ліній або виділених від донорів [8,9]. Дослідження in vitro суттєво сприяли нашому розумінню змін у передачі сигналів на мембрані або цитоплазматичному рівні в поодиноких клітинах [10,11]. Таким чином, хоча, очевидно, існує мережа передачі сигналів між різними тканинами, яка сприяє підтримці енергетичного гомеостазу в організмі людини, більша частина нашого розуміння передачі сигналу обмежується дуже малим простором і часом. Питання про те, як метаболічні сигнали поширюються і переносяться віддаленими тканинами та органами, і як ними модулюється внутрішнє середовище, досі не розглядалося, при цьому було проведено дуже мало досліджень на моделях вищого рівня ендогенного метаболізму, що містять різні клітини або тканини типи.
Матеріал і методи
Клітини
Як і в наших попередніх дослідженнях, пропорції клітин у 3-х режимах представляли співвідношення гепатоцит: адипоцит: ендотелій у вісцеральній області, тобто 12% при 10: 2: 1 для нормо-ваги; 25% при 10: 4: 1 при надмірній вазі; 35% при 10: 6: 1 для людей із ожирінням [18].
Ендотеліальні клітини пуповинної вени людини (HUVEC, пасажі 4-6) були від Promocell. Їх культивували в ECGM (середовище росту ендотеліальних клітин, Promocell) з 10% ді FBS (фетальна бичача сироватка), 0,1 нг/мл EGF (епідермальний фактор росту), 1,0 нг/мл BFGF (основний фактор росту фібробластів), 90 мкг/мл гепарину, 1,0 мкг/мл гідрокортизону та перостреп. Відтепер цей коктейль називають загальнодоступними засобами масової інформації. Клітини (38000) піпетували у μ-предметні стекла, які були приготовані покриттям з 200 мкл 1% желатину з подальшим попереднім інкубуванням протягом 24 годин у печі з температурою 37 ° C.
Клітинна лінія гепатоцитів HepG2 походить від ATCC (American Type Culture Collection). Ці клітини підтримують основні ендогенні функції гепатоцитів людини і реагують на глюкозо-6-фосфат, зберігаючи їх здатність синтезувати глікоген [23]. Гепатоцити пасирували в EMEM з 1 г/л глюкози, 5% FBS та стре-стрептококом. 150 000 клітин ретельно піпетували в центр пористих колагенових каркасів (пористість 98%, розмір пор 200 мкм, модуль пружності 1,2 кПа), поміщені в планшети з 48 лунками. Клітини інкубували у звичайному середовищі за 48 годин до початку підключених експериментів з культурою. Після цього часу клітини проліферують приблизно до 400 000–450 000, як встановлено цитометрією, і готові до експериментів із трьома ходами.
Вісцеральну жирову тканину отримали від n = 9 донорів, які перенесли резекцію печінки на метастатичні/доброякісні ураження печінки без основних хронічних захворювань печінки або діабетичних ускладнень та ІМТ (індекс маси тіла) від 20 до 25. у дослідженні, яке було схвалено Місцевим етичним комітетом (Дослідження № 3059, затверджене 21.07.2011 р. Azienda Ospedaliera Università Pisana). Дослідження проводилось відповідно до рекомендацій, встановлених Місцевим етичним комітетом. Тканину очищали від видимих кровоносних судин і розділяли на зважені порції, що представляють собою i) нормо-вагу, 56 мг, ii) зайву вагу, 112 мг та iii) ожиріння, 168 мг. Зважені зразки поміщали в лунки і частково перетравлювали в колагеназі (Sigma) на 10 хв. Потім їх промивали в ЕМЕМ 20% FBS і перостреппером перед введенням у біореактори. Використовуючи цю процедуру, ми отримуємо вихід близько 1500 адипоцитів/мг [22].