Src-залежна, опосередкована нейтрофілами судинна гіперпроникність та модифікація β-катеніну

1 Кафедри хірургії та медичної фізіології, Інститут серцево-судинних захворювань, Техаський науковий центр охорони здоров'я університету A&M, Темпл, Техас 76504

Анотація

ендотелій судин служить ефективним бар’єром для контролю трансавалярного проходження розчинених речовин, рідини та клітин крові. Зміни бар’єрної функції пов’язані з тромбогенезом, ангіогенезом, запаленням та ішемічно-реперфузійною травмою. Зв'язування агоністів запалення та клітин з ендотеліальними клітинами викликає безліч внутрішньоклітинних сигналів, що може призвести до збільшення проникності ендотелію (12, 19, 30, 34). Взаємодія актоміозину породжує скорочувальні сили, які розтягують тісно пов’язані між собою ендотеліальні клітини, що призводить до високомолекулярного відтоку. Трансмембранний адгезивний білок, який називається судинним ендотеліальним (VE) -кадгерином, утворює ендотеліальні зчеплені з’єднання (AJ), які інгібують парацелюлярний витік макромолекул. Коли рівновага між цими адгезивними і скорочувальними силами змінюється, виникає дисфункція бар’єру та витік.

Попередні дослідження показали, що група запальних клітин, поліморфно-ядерні лейкоцити (ПМН), приєднуються і мігрують через ендотелій в навколишні тканини в місцях пошкодження або запалення, і що цей процес пов'язаний із збільшенням проникності (1, 2, 35). Ми продемонстрували, що ПМН-індукована гіперпроникність відбувається одночасно зі збільшенням фосфорилювання тирозину VE-кадгерину та β-катеніну, важливого члена сімейства білків, що пов'язує комплекс кадгерину з цитоскелетом актину (14, 16, 27). Нещодавно дослідження показали очевидний зв’язок між β-катеніном та тирозинкіназами сімейства Src (Src) (17). Відомо, що кінази Src відіграють роль у передачі сигналів про трансдукцію дисфункції ендотеліального бар’єру та ангіогенезі (9, 13, 15, 24). Активність Src регулюється фосфорилюванням тирозину при Tyr416, який підвищує регуляцію кінази, та Tyr527, що робить Src менш активним (24).

Хімічні речовини та наркотики.

Використовуваними хімічними речовинами були людський рекомбінантний C5a та оксид феніларсину (PAO; Sigma), SRCi та PP1 (Calbiochem), поліклональний анти-Src та поліклональний анти-β-катенін (Santa Cruz), поліклональний антифосфо-Src (Tyr416) та (Tyr527) (Клітинна сигналізація) та поліклональний антифосфотирозин (Трансдукція). SRCi [Ac-Tyr (PO3H2) -Tyr (PO3H2) -Tyr (PO3H2) -Ile-Glu-OH] конкурує за зв'язування з доменами SH2 (31). Негативним контрольним пептидом був [Ac-Asp-Ser (PO3H2) -Thr (PO3H2) -Val-Ser (PO3H2) -OH].

Виділення та перфузія мікросудин.

Аналізи ендотеліальних клітин.

Виділення нейтрофілів.

Свинячих нейтрофілів (ПМН) виділяли, як описано раніше (27). Для активації PMN піддавали впливу людського рекомбінантного C5a (10−8 M). В ізольованих препаратах венул ПМН додавали у суфузійну ванну, а у випадку досліджень HUVEC - безпосередньо на моношарі, в обох випадках у концентрації 10 6/мл. Попередні дослідження показали, що C5a впливає на функцію ендотелію через нейтрофільно-залежні шляхи, проте сам по собі не впливає на проникність (27).

Трансфекція білка.

Для трансфекції венул SRCi судини перфузували протягом 1 год пептидом при 10 мкг/мл у присутності реагенту для трансфекції поліаміну ТрансIT-LT1 (PanVera) при 10 мкл/мл. Попередні дослідження трансфекції із використанням зеленого флуоресцентного білка та різних інгібуючих пептидів показали, що це є підходящим способом введення білків/пептидів у інтактні мікросудини (28). Крім того, ТрансСам по собі IT-LT1 не має очевидного впливу на проникність мікросудин та вазореактивність (28). Для трансфекції HUVEC, SRCi та ТрансIT-LT1 додавали до клітинного середовища з однаковими концентраціями, і трансфекцію дозволяли продовжувати протягом 1 години. Попередні дослідження показали успішну трансфекцію білка ендотеліальних клітин за допомогою цієї методики (26).

Аналіз даних.

В дослідженнях імуноблот було обрано репрезентативне зображення вестерн-плям для представлення. Для кожного втручання проводили щонайменше три повтори, і оптичну щільність білкових смуг усереднювали. Дисперсійний аналіз використовували для оцінки значущості міжгрупових відмінностей в імуноблот-аналізі та дослідженнях проникності. Значення

Рис. 1.Поліморфно-ядерні лейкоцити (ПМН), індукована венулярною гіперпроникністю. Венули перфузували альбумін-фізіологічним розчином солі (APSS), і коефіцієнт базальної проникності альбуміну (Па) визначали протягом 1 години (перший бар у кожній групі). Результати виражаються у відсотках від базальних. Лікування було таким: a: неактивований свинячий PMN (10 6/мл),: C5a (10 -8 М), c: C5a активований PMN, d: SRCi трансфікований протягом 1 год з подальшим активацією C5a PMN, e: пептид негативного контролю, трансфікований протягом 1 год з подальшою активацією C5a ПМН, f: PP1 (10-6 М), після чого активований C5a PMN, та g: DMSO (0,05%) з подальшим активацією C5a PMN. Значення є середніми ± SE. * Значне збільшення базальної проникності,

Індукована ПМН гіперпроникність у культивованих ендотеліальних клітинах.

Щоб визначити, що реакція проникності моношарів ендотеліальних клітин узгоджується з реакцією інтактних венул, HUVEC піддавались активованим PMN після трансфекції SRCi або пептидом негативного контролю або впливу PP1. Як показано на фіг.2, активовані ПМН індукували значні реакції гіперпроникності вище рівня контролю. Крім того, супернатант, отриманий після центрифугування активованих ПМН, мав подібний вплив на проникність (рис. 2c). Однак SRCi повністю скасував це збільшення проникності (рис. 2e). Трансфекція пептиду негативного контролю не блокувала ПМН-індуковану гіперпроникність (рис. 2g). За погодженням із ефектом SRCi, PP1 також блокував ПМН-індуковану гіперпроникність (рис. 2i), тоді як транспортний засіб DMSO не мав ефекту (рис. 2k).