Стабільне виробництво тетродотоксину Bacillus sp

Мельникова Дарія Іванівна

1 А.В. Жирмунського національного наукового центру морської біології Далекосхідного відділення Російської академії наук, Владивосток 690041, Росія; ur.ovd.bmi@avokinlemd (D.I.M.); ur.ovd.bmi@oknesalva (A.E.V.)

Анна Євгеновна Власенко

Тимур Ю. Магарламов

2 Школа біомедицини, Далекосхідний федеральний університет, Владивосток 690090, Росія

Анотація

Вперше тетродотоксин (ТТХ) був виявлений у штамі бактерій після п’яти років вирощування в лабораторних умовах з моменту його ізоляції від хазяїна тварини. Надійний метод, придатний для зразків бактерій, високоефективна рідинна хроматографія з тандемною мас-спектрометрією, був використаний для виявлення токсинів у спорових та вегетативних культурах Bacillus sp. 1839. TTX був виявлений у споровій культурі штаму.

1. Вступ

Тетродотоксин (ТТХ), який є одним із найвідоміших низькомолекулярних нейротоксинів, здатних блокувати напружені канали натрію в нервових та м’язових тканинах, був виявлений у великій кількості морських і наземних організмів, а також морських та прісноводних відкладень [1]. Походження його в організмах та екосистемах досі залишається спірним питанням, але виявлення численних штамів бактерій, здатних до утворення ТТХ, виділених із вищезазначених джерел, свідчить про зв’язок між бактеріями та токсином. Існування бактеріального штаму, який, як було доведено, виробляє ТТХ незалежно від організму господаря, може суттєво полегшити відкриття досі невідомих шляхів біосинтезу ТТХ. Тим не менше, однією з головних проблем, пов'язаних з бактеріями, що продукують ТТХ, є нездатність більшості виявлених бактерій виробляти токсин шляхом тривалого культивування або навіть після кількох пасажів [2]. Іншим важливим питанням є метод виявлення ТТХ. Незважаючи на різні методологічні підходи, засновані на антигенній специфічності, нейротоксичному ефекті або фізико-хімічних властивостях токсину, що використовується в дослідженнях з дослідженнями бактерій, лише рідинна хроматографія з тандемною мас-спектрометрією на сьогоднішній день може вважатися найбільш специфічною та надійною [1].

Наша дослідницька група працювала над проблемою розподілу ТТХ у морських екосистемах з особливим акцентом на скринінгу бактеріальних виробників ТТХ протягом декількох років. Пошук бактерій, що продукують ТТХ, у токсичному стрічковому черв’яку, що несе ТТХ, Cephalothrix simula за допомогою конфокальної лазерної скануючої мікроскопії з поліклональними антитілами до TTX, проведений у 2014 році, виявив позитивне мічення TTX у бактеріальних клітинах штаму Bacillus [3]. Детальне дослідження Bacillus sp. штам 1839 за допомогою імуноелектронної мікроскопії з антитілами до ТТХ показав сувору зв'язок мічення ТТХ з ендоспорами та вільними спорами бактерій [4]. Подальші дослідження життєвого циклу [5] та умов спороношення [6] показали, що штам був TTX-позитивним навіть після численних пасажів протягом трьох років з моменту його відкриття, що в поєднанні із споровим синтезом TTX робить його унікальним серед інших ТТХ-продукуючі бактерії. Це вказує на важливість підтвердження виробництва ТТХ Bacillus sp. 1839 р. Більш надійними методами виявлення токсинів.

Сучасні дослідження - це перший звіт про синтез TTX бактеріями після п’яти років після його виділення. TTX був виявлений у споровій культурі Bacillus sp. штам 1839 з використанням високоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС/МС).

2. Результати

В результаті аналізу HPLC-MS/MS спорової та вегетативної культури Bacillus sp. 1839 р. Було виявлено TTX (рисунок 1 А, таблиця 1). Токсин був виявлений лише в споровій культурі штаму. Спектр фрагментації MS/MS Bacillus sp. Екстракт спорової культури 1839 р. Показав характерні фрагментні іони попередника TTX (M + H) + m/z 320: (M + H-H2O) + при m/z 302 та (M + H-C3H7O6) + при m/z 162 ( Малюнок 1 Б).