Визначення протизапальних олігосахаридів, отриманих з галактозаміногалактану (GAG)
Маркус ressресслер
1 Unité des Aspergillus, Інститут Пастера, Париж, Франція
Крістоф Геддерготт
1 Unité des Aspergillus, Інститут Пастера, Париж, Франція
Інес С. Н'Го
1 Unité des Aspergillus, Інститут Пастера, Париж, Франція
Джорджія Ренга
2 Кафедра експериментальної медицини, Університет дельї Студі ді Перуджа, Перуджа, Італія
Василіс Ойконому
2 Кафедра експериментальної медицини, Університет дельї Студі ді Перуджа, Перуджа, Італія
Сільвія Моретті
2 Кафедра експериментальної медицини, Університет дельї Студі ді Перуджа, Перуджа, Італія
Бернадетт Коддевіль
3 Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle (UGSF) UMR 8576 CNRS, Університет Лілля, Лілль, Франція
Йоана Гайфем
4 Науково-дослідний інститут наук про життя та здоров'я (ICVS), Медичний факультет, Університет Міньйо, Брага, Португалія
5 ICVS/3B's-PT Урядова асоційована лабораторія, Брага, Португалія
Рікардо Сільвестр
4 Науково-дослідний інститут наук про життя та здоров'я (ICVS), Медичний факультет, Університет Міньйо, Брага, Португалія
5 ICVS/3B's-PT Урядова асоційована лабораторія, Брага, Португалія
Луїджина Романі
2 Кафедра експериментальної медицини, Університет дельї Студі ді Перуджа, Перуджа, Італія
Жан-Поль Латге
1 Unité des Aspergillus, Інститут Пастера, Париж, Франція
Тьєррі Фонтен
1 Unité des Aspergillus, Інститут Пастера, Париж, Франція
Пов’язані дані
Усі набори даних, створені для цього дослідження, включені до статті/Додаткового матеріалу.
Анотація
Галактозаміногалактан (GAG) - це нерозчинний аміноцукровий полімер, вироблений Aspergillus fumigatus і має протизапальні властивості. Тут досліджували мінімальні глікозидні послідовності, необхідні для індукції IL-1Ra мононуклеарними клітинами периферичної крові (РВМС). Використовуючи хімічну деградацію природного GAG для виділення розчинних олігомерів, ми виявили, що де-N-ацетилювання залишків галактозаміну та розмір олігомеру є критичними для імунної відповіді in vitro. Для протизапальної відповіді необхідний мінімальний розмір олігомеру 20 залишків галактозаміну, але наявність залишків галактози не є необхідним. У моделі миші, викликаної колітом, викликаною сульфатом декстрану, частка де-N-ацетильованих олігомерів з 13 ключових слів: галактозаміногалактан, Aspergillus fumigatus, IL-Ra, протизапальна реакція, глікопрепарат
Вступ
Хімічна модифікація полісахаридів
Де-N-ацетилювання полісахаридів
GAG суспендували в 3 мл 10 мМ HCl при кінцевій концентрації 3,33 мг/мл ультразвуком у пластикових пробірках. Де-N-ацетилювання починали додаванням 3,4 мл 18,8 М NaOH і суміш інкубували при 100 ° C протягом 4–5 годин. Трубки вихровували щогодини. Реакцію зупиняли на льоду і нейтралізацію 12 М HCl. Суміш буферизували за допомогою 20 мМ трис, рН 7. Де-N-ацетильовані ГАГ (dGAG) діалізували проти водопровідної води та двічі проти dH20 (24 години кожен) і, нарешті, ліофілізували насухо і зберігали при температурі навколишнього середовища.
Ацетилювання олігосахаридів
Процедура ацетилювання, описана Lavertu et al. (2012) був модифікований наступним чином: 0,5 мг олігосахаридів dGAG (F-I та F-III) ліофілізували насухо і розчиняли у 25 мкл 400 мМ оцтової кислоти та 100 мкл CH3OH. Суміш попередньо інкубували протягом 1 год при температурі навколишнього середовища при перемішуванні при 300 об/хв. Ацетилювання ініціювали додаванням 3 мкл ангідриду оцтової кислоти. Через 1 год інкубації розчинники випарювали в ексикаторі протягом ночі. Зразки знесолювали шляхом багаторазового розчинення 500 мкл води (4 рази) з подальшим випаровуванням насухо. Зразки розчиняли у 500 мкл води і, нарешті, зберігали при -20 ° C.
Виробництво олігосахаридів GAG
Аналітичні процедури
Аналіз MBTH
Де-N-ацетильовані вісіміни були виявлені та визначені кількісно за допомогою аналізу MBTH (Plassard et al., 1982). Процедуру проводили в 96-лунковому планшеті (Сарштедт): 40 мкл зразка (що містив до 200 мкг вісім омін/мл) змішували з 40 мкл 5% KHSO4 (Sigma Aldrich). Зразки зменшували додаванням 40 мкл 5% NaNO2 (Sigma Aldrich) протягом 60 хв при 50 ° C, в результаті чого 40 мкл 5% NaCl використовували як негативний контроль. Після нейтралізації 40 мкл 12,5% NH4SO2NH2 (Sigma Aldrich) (температура навколишнього середовища, 30 об/хв, 10 хв) додавали 40 мкл 0,5% 3-метил-2-бензотіазолінон гідразидгідрату гідрату (Sigma Aldrich). Покриту пластину інкубували при 37 ° С протягом 30 хв. Нарешті, додавали 40 мкл 0,5% FeCl3 і поглинання при λ = 650 нм вимірювали за допомогою зчитувача пластин Tecan M200Pro ELISA, тоді як λ = 800 нм служив еталонною довжиною хвилі. Калібрувальною кривою послідовного розведення d -галактозаміну (GalN) служила еталоном. Для кількісної оцінки загальної кількості осіміну або ступеня ацетилювання (DA) перед аналізом MBTH проводили стадію гідролізу. Зразки повністю гідролізували 4 М HCl при 100 ° С протягом 4 год і згодом сушили протягом ночі в ексикаторі.
Ацетатна проба
DA також оцінювали за допомогою ферментативного ацетатного аналізу. Зразки (220 мкл) повністю гідролізували додаванням 100 мкл 12 М HCl (100 ° С, 4 год). Потім 100 мкл використовували для виявлення осеміну методом аналізу MBTH, як описано вище, і ще 100 мкл використовували для аналізу ацетату. Після нейтралізації додаванням 75 мкл 7 М NaOH та 75 мкл 2 М MOPS (рН 7,5) зразки піддавали ацетатному колориметричному аналізу (Sigma-Aldrich) згідно з протоколом виробника. Поглинання при λ = 450 нм вимірювали за допомогою зчитувача пластин ELISA від Tecan нескінченного M200Pro, тоді як λ = 700 нм служив еталонною довжиною хвилі. Вміст ацетату в гідролізованих зразках визначали калібрувальною кривою 0,25–1,5 мМ стандартного розчину ацетату.