Вплив дієти та генетичного фону на білок-1c, що зв’язує елементи, що регулюють стерин,

Анотація

FPLC, швидкодіюча рідинна хроматографія
Харчова дієта з високим вмістом жиру
LFD, дієта з низьким вмістом жиру
MUFA, мононенасичена жирна кислота
PGC, активатор проліфератора пероксисоми рецептор-γ-коактиватор
SCD, стеароїл-КоА десатураза
SOCS, супресор сигналізації цитокінів
SREBP, білок, що зв'язує елементи, що регулюють стерол

Метаболічний синдром - це сукупність знахідок, включаючи центральне ожиріння, резистентність до інсуліну, дисліпідемію, гіпертонію та стеатоз печінки, які схильні до діабету, серцево-судинних захворювань та раку. Оскільки поширеність діабету, ожиріння та метаболічного синдрому набуває приголомшливих масштабів, велика увага приділялася їх етіології та взаємозв’язкам між ними (1,2). Хоча як генетичні фактори, так і фактори навколишнього середовища однозначно відіграють певну роль, як саме ці фактори взаємодіють, виробляючи метаболічний синдром та його різні компоненти, залишається незрозумілим.

У більшості людей резистентність до інсуліну виявляється полігенною та неоднорідною (3). Таким чином, існує безліч генів, які потенційно можуть сприяти фенотипу, і розвиток хвороби у будь-якої особини може залучати лише певну підмножину цих генів, яка варіюється в залежності від популяції. Вважається, що популяції з високим ризиком, схильні до розвитку ожиріння та резистентності до інсуліну, такі як індіанці Піма та американські мексиканці, збагачуються на кластери генів, що діють разом, щоб викликати метаболічний синдром у контексті відповідного тригерного середовища, такого як західна дієта з високим вмістом жиру.

Порушення регуляції ліпідного обміну печінки може відігравати центральну роль у патогенезі метаболічного синдрому. МакГаррі (7) припустив, що підвищений синтез ліпідів печінкою викликає резистентність до інсуліну в інших тканинах, таких як м'язи. Збільшення накопичення ліпідів у печінці призводить до жирових змін, які зараз відомі як особливість метаболічного синдрому (8). Ці зміни формують спектр патології, позначеної як неалкогольна жирова хвороба печінки, починаючи від простого доброякісного стеатозу і закінчуючи неалкогольним стеатогепатитом, який може перерости в цироз та печінкову недостатність (9). Існує думка, що неалкогольна жирова хвороба печінки зараз може бути найпоширенішою причиною криптогенного цирозу в цій країні (10). Пацієнти з метаболічним синдромом також мають підвищений рівень тригліцеридів та знижений рівень ЛПВЩ (11). Дисліпідемія тісно пов’язана із серцево-судинними захворюваннями, пов’язаними з метаболічним синдромом, і, принаймні частково, це може бути пов’язано з аномальним поводженням з печінкою ліпідів (12).

Щоб зрозуміти, як гени взаємодіють з харчовим жиром, виробляючи зміни в ліпідному обміні, що відбуваються при метаболічному синдромі, ми використали два штами мишей, що представляють відмінності у сприйнятливості до розвитку інсулінорезистентності. Раніше було показано, що у мишей C57Bl/6 (B6) розвивається діабет при генетично індукованій інсулінорезистентності внаслідок подвійної гетерозиготної делеції одного алелю рецептора інсуліну та одного алелю субстрату-1 рецептора інсуліну (13,14). Натомість миші 129Sv (129) захищені від діабету, коли мають один і той же рецептор інсуліну/субстрат рецептора інсуліну-1 подвійний гетерозиготний дефект. У цьому дослідженні мишей В6 та 129 було встановлено дві крайні дієти: дієта з низьким вмістом жиру (LFD; 14% калорій з жиру) та дієта з високим вмістом жиру (HFD; 55% калорій з жиру). Ми порівняли вплив генетичних та дієтичних факторів не тільки на глюкозу, але також на сироваткові та печінкові ліпідні профілі та експресію ліпогенних генів печінки, щоб краще зрозуміти, як ці фактори змінюють ліпідний обмін, та визначити ключові елементи, що контролюють прогресування метаболізму. синдрому.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Шеститижневих самців мишей C57Bl/B6 та 129S6/SvEvTac (Taconic) поміщали на дієту з низьким вмістом жиру з високим вмістом вуглеводів (NIH # 31; Taconic) або з низьким вмістом вуглеводів (TD93075; Harlan Teklad). LFD отримує 14% калорій з жиру, 25% калорій з білка та 61% калорій з вуглеводів, і було виявлено, що він містить 1,5% насичених жирних кислот, 2,7% мононенасичених жирних кислот (MUFA) та 0,6% поліненасичених жирних кислот за вагою. HFD отримує 55% калорій з жиру, 21% калорій білка та 24% калорій з вуглеводів, і було встановлено, що він містить 4,2% насичених жирних кислот, 5,0% MUFA та 11,2% поліненасичених жирних кислот. LFD та HFD мають 15,4 та 7,1 мг холестерину на 100 г відповідно. Арахідонова кислота не була виявлена в обох дієтах. Мишей підтримували протягом 12-годинного циклу світло-темно; якщо не вказано інше, відбирали зразки сироватки і мишей вбивали між 9:00 та 11:00 ранку у неміцному стані у віці ∼6 місяців. Рівні інсуліну вимірювали у зразках плазми випадково вигодованих мишей, використовуючи набір Crystal Chem ELISA та стандарти мишачого інсуліну. Для проведення цих експериментів були використані три незалежні когорти.

Аналіз ліпідів у сироватці крові.

Були об’єднані рівні обсяги сироватки від трьох до чотирьох мишей, які голодували протягом 6 год (починаючи з ранку). Вимірювали рівень холестерину та тригліцеридів за допомогою наборів Sigma 352 та 339, пристосованих для мікротитраційних пластин. Крім того, сироватку піддавали швидкодіючій рідинній хроматографії (FPLC), як описано раніше (15), і холестерин вимірювали в елюйованих фракціях. Аналіз ліпідів в сироватці крові проводили ядро ліпідів, ліпопротеїнів та атеросклерозу центрів метаболічного фенотипування мишей Вандербільта.

Імуногістохімія.

Печінку мертвих тварин заморожували в рідкому азоті, вкладали в ріжучий склад оптимальної температури і розрізали на ділянки 6 мкм. Фарбування гематоксиліном/еозином та масло-червоний-О проводили із застосуванням стандартних методик.

Аналіз печінкових ліпідів.

Аналіз ліпідів печінки проводили ядро ліпідів, ліпопротеїнів та атеросклерозу центрів метаболічного фенотипування мишей Вандербільта. Ліпіди екстрагували, фільтрували та відновлювали у фазі хлороформу. Окремі класи ліпідів розділяли тонкошаровою хроматографією з використанням пластин на силікагелі 60 А та візуалізували родаміном 6G. Фосфоліпіди, тригліцериди та складні ефіри холестерину вишкрібали, метилювали та проаналізували за допомогою газової хроматографії (16,17).

Олігонуклеотидні мікрочипи.

Загальну РНК (25 мкг) об'єднували від двох до трьох тварин для отримання кРНК, як описано раніше (18). кРНК (15 мкг) гібридизували на мишачих чіпах Affymetrix U74Av.2, причому чотири чіпи представляли кожну групу. Дані аналізували за допомогою MAS v5, причому кожен мікросхем був нормалізований до середньої інтенсивності 1500.

ПЛР у режимі реального часу.

Загальну РНК екстрагували та очищали за допомогою набору RNeasy (Qiagen) та використовували для направлення синтезу кДНК за допомогою набору RT для ПЛР (Clontech). RT-PCR проводили, використовуючи основну суміш SYBR green (ABI), 5% реакції синтезу кДНК та 300 нмоль/л відповідних праймерів. Праймери, що зв’язують регулюючий елемент стеролу (SREBP) -1c та SREBP-1a, були специфічними для ізоформи і були раніше описані (19). Інші праймери були такими: супресор сигналізації цитокінів (SOCS) -3, 5′-CCTCGGGGACCATAGGAG-3 ′ та 5′-AACTTGCTGTGGGTGACCAT-3 ′; SREBP-2, 5′GCGTTCTGGAGACCATGGA-3 ′ та 5′-ACAAAGTTGCTCTGAAAACAAATCA-3 ′; активований проліфератором пероксисоми рецептор-γ-коактиватор (PGC) -1α, 5′-GTCAACAGCAAAAGCCACAA-3 ′ і 5′-TCTGGGGTCAGAGGAAGAGAg-3 ′; та PGC-1β, 5′-CCCTGTCCGTGAGGAACG-3 ′ та 5′-ATCCATGGCTTCGTACTTGC-3 ′. Було виявлено, що праймери ампліфікуються лінійно. Оскільки загальноприйняті гени ведення домашнього господарства, такі як TATA-зв’язуючий білок та рибосомний білок 36B4, варіювали між штамами, експресія була нормалізована до вхідної РНК і розрахована як функція 2 −C .