Вплив Еноанта та ішемії та реперфузії на метаболіти лінз щурів
1 Стамбульська навчально-дослідна лікарня, офтальмологічна клініка, Фатих, 34098, Стамбул, Туреччина
2 Кафедра фізіології медичного факультету університету Єні Юзил, Топкапи, Стамбул, Туреччина
3 Стамбульський університет, кафедра нейронауки, Інститут експериментальної медицини, Стамбул, Туреччина
4 Кафедра аналітичної хімії, фармацевтичний факультет, Університет Безміалем Вакіф, Фатих, 34093, Стамбул, Туреччина
5 Факультет технічних та природничих наук, Університет Сабанджі, Тузла, Стамбул, Туреччина
Анотація
Було досліджено вплив ішемії та реперфузії на метаболіти кришталика та вплив фітотерапевтичного комерційного продукту під назвою “Enoant” (змішаний вміст поліфенолу) на вибрані метаболіти кришталика. З цією метою 30 щурів Wistar було розділено на три групи відповідно до їх раціону та підданих ішемії. 10 щурів, що належали до групи I, годували сухим раціоном; інші 10 (група II) годувались сухим раціоном та пили воду з Enoant. Наприкінці 15-денного періоду обидві групи щурів піддавались ішемії протягом 2 годин і реперфузували. Ще через 15 днів при такому ж харчуванні щури були обезголовлені. Решта 10 щурів, які не піддавалися ішемії (ІІІ група), годувались лише сухим раціоном. Для визначення лінзових метаболітів кожної групи щурів використовували 1 ЯМР-спектроскопію. Результати, отримані з трьох груп, були порівняні статистично. Відмінності метаболітів були значними, крім пірувату та сукцинату. Пероральне введення Enoant виявило ефекти на підвищення стабілізації мембрани, антиоксидантну здатність, осмотичну здатність молекули регулятора та вміст сорбіту в кришталику, порушеному ішемією. Enoant можна використовувати там, де утворюється окислювальний або осмотичний стрес.
1. Вступ
Як життєва необхідність, окислювальні явища в клітинах викликають утворення активних форм кисню (АФК) і нейтралізуються в кришталику за допомогою ферментативних або неферментативних засобів [1–3]. Недостатність в антиоксидантних системах стимулює вироблення декількох запальних білків, які сприяють процесу клітин, що сприяють пошкодженню ліпідів, ДНК, вуглеводів та білків.
Метаболіти кришталика та рогівки вивчаються за допомогою спектроскопії ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) з 1980-х років. Через легкість їх застосування екстракти хлорної кислоти досліджувались до останніх років для визначення метаболітів. В останні роки 1 HNMR застосовують більше, особливо в пухлинних тканинах, для відстеження ефекту апоптотичних стимуляцій [15–18]. Найбільш часто досліджуваним маркером окисного пошкодження тканин є тіобарбітурова реактивна речовина (TBARS), а найчастіше маркером для вимірювання антиоксидантної здатності є відновник глутатіон (GSH). Ми прагнули дослідити вплив на метаболіти кришталика, спричинені застосуванням ішемії/реперфузії (I/R), та вплив на вибрані метаболіти кришталика, спричинені комерційним продуктом під назвою “Enoant”, який, як відомо, має високі антиоксидантні характеристики через змішаний вміст поліфенолу та введений як дієтична добавка та стандартизований концентрат винного екстракту без спирту.
2. Матеріал і методи
2.1. Дослідження концентрату винних екстрактів
Enoant люб’язно надала компанія Te-ha Cosmetic Company (Стамбул, Туреччина). Вміст поліфенолів у Enoant, витягнутих із шкірок та кісточок винограду, визначали рідинною хроматографією високого тиску (ВЕРХ) у вигляді 1,47 мг/мл катехіну, 0,88 мг/мл епікатехіну, 130 мг/мл кверцетину та 23 мг/мл ресвератролу [19].
2.2. Дослідження лінз
Підготовка тварин була такою: всі дослідження на тваринах проводяться відповідно до директив Європейської комісії з питань навколишнього середовища (86/609/ЄЕС). Самці щурів-альбіносів Wistar (
) вагою 200–250 г були використані в цьому експерименті. Тварин утримували по 3-4 щура в лабораторних клітках і витримували протягом 12 годин циклу світло-темно, з вільним доступом до стандартних лабораторних умов протягом принаймні 1 тижня до експерименту. Десять з них були названі групою I, яких годували сухим раціоном. Інші 10 щурів (ІІ група), крім дієти, отримували Еноант перорально у свіжій питній воді (1,25 г/кг/день) протягом 15 днів. Наприкінці 15-денного періоду двосторонні каротиди щурів підв’язували протягом 2 годин і утворювали ішемію. Потім вони отримали відшкодування наприкінці 2-годинного періоду. Решта 10 щурів продовжували лише суху дієту (ІІІ група). Цих щурів, які дотримувались дієти протягом 15 днів, забивали із застосуванням перитонеального тіопенталу (100 мг/кг). Лінзи 3 щурів з кожної групи заморожували для приготування екстракту хлорної кислоти. TBARS підтримували в одній з лінз кожного з 7 решти щурів, а редуктор GSH - в інших лінзах. Спектри 1 ЯМР 3 щурів брали в екстрактах хлорно-кислотної кислоти.
2.3. Приготування та аналіз екстрактів хлорно-кислотної кислоти
Заморожені лінзи подрібнювали на фарфоровій ступці та маточці, охолоджені рідким азотом. Хлорна кислота (300 μL 10%) додавали до тканинного порошку і порошок безперервно перемішували до консистенції замороженої пасти.
Заморожений зразок негайно центрифугували при 3000 g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант нейтралізували 0,1 М гідроксидом калію до значень рН 7,0–7,2. Потім зразок центрифугували при 3000 g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі і збирали кінцевий супернатант [20].
Підготовлені супернатанти сушили під вакуумом і розчиняли в 0,3 мл оксиду дейтерію (D20). Спектри 1 HNMR були отримані за допомогою спектрометра Varian Unity Inova 500 (11,7 Т), що працює на 500 МГц для протонів.
Крім того, велика кількість накладених піків, які належать глюкозі, фруктозі та сорбіту, знаходиться в просторі між 3,00 і 5,00 ppm. Ось чому триплет в просторі між 3,71 і 3,74 ppm для сорбіту був прийнятий за еталон. На додаток до цього, в літературі повідомляється, що триплет 3,73 збільшився через дефіцит сорбітолдегідрогенази [31]. Відносні інтеграли еталонних піків вибраних метаболітів у просторі від 0,5 до 5,00 ppm були взяті з урахуванням води, оскільки вода була нерухомо введена в препараті 1 HNMR групи I, II та III. А середні відносні інтегральні результати серед кожної 3 групи порівнювали статистично.
2.4. Вимірювання рівнів GSH лінз
Розчин депротеїнази (120 г NaCl, 6,68 г м-фосфорної кислоти та 0,8 г ЕДТА) додавали до 10% тканинного гомогенату кришталика. Обложені білки видаляли центрифугуванням. До супернатанту додавали 0,6 М динатрію фосфату та 5,5′-дитио-біс-2-нітробензойну кислоту (DTNB) як реагент, і зразки вимірювали при 412 нм протягом 5 хвилин. Результати були виражені як μмоль/г тканини [32].
2.5. Вимірювання рівня TBARS лінз
10% гомогенат лінз готували з 0,15 М KCL. 50 μL 8,1% додецилсульфату натрію, 50 μL оцтової кислоти (доведено до рН 3,5) та 100 μДо 50 додавали реагенти L тіобарбітурової кислоти (TBA) μL гомогенат. Реакційну суміш витримували на киплячій водяній бані протягом 45 хвилин. Після охолодження до кімнатної температури TBA екстрагували н-бутанолом/піридином (15: 1). Зразки вимірювали при 535 нм. Результати розраховували як нмол/г тканини [33].