Вплив лимонної кислоти на окислювальний стрес на мозок та печінку у мишей, оброблених ліпополісахаридами
Омар М. Е. Абдель-Салам
1 Відділ токсикології та наркотиків, Національний дослідницький центр, Каїр, Єгипет
Еман Р. Юнесс
2 Кафедра медичної біохімії, Національний дослідницький центр, Каїр, Єгипет
Надія А. Мухаммед
2 Кафедра медичної біохімії, Національний дослідницький центр, Каїр, Єгипет
Сафаа М. Юсеф Морсі
2 Кафедра медичної біохімії, Національний дослідницький центр, Каїр, Єгипет
Енайат А. Омара
3 Кафедра патології, Національний дослідницький центр, Каїр, Єгипет
Амані А. Слім
4 Кафедра фармакології, Національний дослідницький центр, Каїр, Єгипет
Анотація
Вступ
Лимонна кислота (2-гідрокси-1,2,3-пропан-трикарбонова кислота) - це слабка органічна кислота, що міститься у найбільшій кількості в цитрусових, таких як лимон, грейпфрут, мандарин та апельсин. Лимонний і лаймовий соки - багаті джерела. 9 Він використовується як природний консервант, а також для додавання кислого (кислого) смаку їжі та безалкогольних напоїв. 10 Будучи компонентом трикарбонової кислоти або циклу Кребса, лимонна кислота міститься у всіх тканинах тварин як проміжна речовина в окисному метаболізмі. Дослідження показали, що цитрат зменшує перекисне окислення ліпідів і знижує регуляцію запалення за рахунок зменшення дегрануляції поліморфно-ядерних клітин і послаблення вивільнення мієлопероксидази, еластази, інтерлейкіну (IL) -1β і тромбоцитарного фактора 4. 11-13 In vitro цитрат покращує функцію ендотелію за рахунок зменшення запалення маркери та зменшення діапедезу нейтрофілів при гіперглікемії. 14 Більше того, було показано, що лимонна кислота зменшує гепатоцелюлярні ушкодження, викликані у щурів тетрахлоридом вуглецю. 15 Лимонна кислота може таким чином довести свою цінність у зменшенні окисного стресу.
Таким чином, з огляду на антиоксидантну та протизапальну дію цитрату, про яку повідомляється зараз, і оскільки цитратна антикоагуляція застосовується у важких хворих, доцільним було вивчити вплив введення лимонної кислоти на окислювальний стрес та пошкодження тканин на моделі системних запальних захворювань, спричинених внутрішньоочеревинним (ip) ліпополісахаридом (LPS) введенням мишам. LPS є складовою клітинних стінок грамнегативних бактерій. При системному введенні LPS сильно стимулює імунні клітини на периферії (через білки плазматичної мембрани, наприклад, так званий рецептор 4 [TLR4] і CD14), щоб виділити прозапальні цитокіни, такі як фактор некрозу-альфа (TNF-α), IL -1β, а IL-6 на периферії та мозку. Це призводить до розвитку системного та нейрозапалення. Індукована LPS 16–19 ендотоксемія є добре встановленою моделлю зараження грамнегативними бактеріями і широко використовується для вивчення впливу ендотоксинів на периферичну тканину/органи та впливу системного запалення на мозок.
Матеріали і методи
Тварини
Використовували швейцарських мишей-самців-альбіносів вагою 22–25 г (віком 5–6 тижнів). Мишей отримували з колонії домашніх тварин Національного дослідницького центру. Стандартні лабораторні продукти харчування та вода надавались за бажанням. Процедури на тваринах проводили відповідно до Комітету з етики Національного дослідницького центру та дотримувались рекомендацій Національного керівництва інститутів охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин (Публікація № 85-23, переглянута 1985 р.).
Наркотики та хімікати
Використовували очищений, ліофілізований ендотоксин кишкової палички (серотип 055: В5; Sigma); його розчиняли у стерильному фізіологічному розчині, розподіляли аликвотами та заморожували при -20 ° C. Для всіх експериментів використовували одні й ті ж розчини запасів. Лимонна кислота та всі інші хімічні речовини були аналітичного класу і отримувались від Sigma. Доза LPS (200 мкг/кг) та час відбору проб тканини базувалися на попередніх дослідженнях. 20
Вивчати дизайн
Мишей випадковим чином розділили на п'ять рівних груп (по шість мишей у кожній). Мишей обробляли або 0,2 мл: стерильного фізіологічного розчину (група 1), або лимонної кислоти в дозах 1, 2 та 4 г/кг, перорально (групи 2–4). Лікування проводили безпосередньо перед введенням ендотоксину (LPS: 200 lg/kg, вводили внутрішньочеревно, 0,1 мл). П’ята група отримала лише транспортний засіб, без LPS (негативний контроль). Мишей евтаназували через 4 год LPS або ін’єкції носія шляхом декапітації під ефірною анестезією, де мозок і печінку кожної миші видаляли, промивали крижаним сольовим розчином, забуференним фосфатом (PBS; pH 7,4), зважували і зберігали при -80 ° C до біохімічного аналізу. Тканини гомогенізували 0,1 М PBS при рН 7,4, отримуючи кінцеву концентрацію 0,1 г/мл для біохімічних аналізів. У тканинах мозку та печінки визначали знижену активність GSH, малонового діальдегіду (MDA), оксиду азоту (нітрити), GPx та параоксонази 1 (PON1). ФНО-α вимірювали в тканині мозку. У тканині печінки вимірювали аланінамінотрансферазу (АЛТ), аспартатамінотрансферазу (АСТ) та фрагментацію ДНК.
Визначення перекисного окислення ліпідів, зниженого рівня GSH та рівня нітритів
Перекисне окислення ліпідів аналізували шляхом вимірювання рівня MDA в тканині мозку за допомогою методу Ruiz-Larrea та співавт. 21 Знижений GSH визначали в тканині методом Еллмана. 22 Оксид азоту, виміряний як нітрит, визначали за допомогою реагенту Гріса за методом Мошаге та співавт. 23
Визначення активності GPx
Активність GPx у супернатантах визначали спектрофотометрично при 340 нм аналізом окиснення NADPH за допомогою набору глутатіонпероксидази (Biodiagnostics). 24 Одна одиниця активності GPx визначається як кількість білка, який окислюється 1 мМ NADPH за хвилину. Активність GPx виражається як мО/мл.
Визначення активності параоксонази
Активність арилестерази параоксонази вимірювали спектрофотометрично у супернатантах, використовуючи в якості субстрату фенілацетат. 25,26 У цьому аналізі арилестераза/параоксоназа каталізує розщеплення фенілацетату, що призводить до утворення фенолу. Швидкість утворення фенолу вимірюється шляхом відстеження збільшення поглинання при 270 нм при 25 ° С. Робочий реагент складався з 20 мМ трис/HCl буфера (рН 8,0), що містив 1 мМ хлориду кальцію та 4 мМ фенілацетату в якості субстрату. Додають зразки, розведені в буфері 1: 3, і реєструють зміну поглинання через 20 секунд затримки. Поглинання при 270 нм приймали кожні 15 с протягом 120 с, використовуючи спектрофотометр, що реєструє УФ-Vis (Корпорація Shimadzu). Одна одиниця активності арилестерази дорівнює 1 мкМ фенолу, що утворюється за хвилину. Активність виражається в кО/л, виходячи з коефіцієнта екстинкції фенолу 1310 М/см при 270 нм, рН 8,0 та 25 ° С. Пусті зразки, що містять воду, використовуються для корекції спонтанного гідролізу фенілацетату.
Визначення TNF-α, фрагментація ДНК та ферменти печінки
TNF-α тканини визначали в тканині мозку згідно з Chen et al. 27 за допомогою імуноферментного аналізу з використанням наборів TNF-α (Biosource International) та зчитувача мікропланшетів (Fisher Biotech). Кількісне визначення фрагментації ДНК в тканині печінки проводили за методикою, описаною Герсел-Тейлором. 28 Активність ALT та AST у печінці вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів (BioMérieux). 29,30
Гістологічна оцінка ураження печінки
Печінку у кожної миші швидко видаляли і фіксували у свіжоприготовленому 10% нейтральному буферизованому формаліні, регулярно обробляли і вкладали у парафін. Зрізи товщиною 5 мкм вирізали та фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) для гістопатологічного дослідження. Всі зрізи досліджували за допомогою світлового мікроскопа.