Втрата білків Smarc погіршує мозочковий журнал розвитку неврології
Анотація
- AT/RT
- мозку
- мозочок
- розвитку
- Смарк
- пухлина
Вступ
Матеріали і методи
Трансгенні миші.
Покоління мишей, що несуть флангований loxP екзон 1 гена Smarcb1 або ген, флангований loxP Smarca4, було раніше описано (Roberts et al., 2002; Indra et al., 2005). Ці миші були схрещені мишами Math1-cre (Schüller et al., 2007) для отримання Math1-cre: Smarcb1 fl/fl та Math1-cre: Smarca4 fl/fl мишей. Мишей утримували в стандартних умовах. Генотипування проводили за допомогою стандартної ПЛР із використанням специфічних для праймерів Cre (5′-TCCGGCTGCCACGACCAA-3 ′ і 5′-GGCGCGGCAACACCATTTT-3 ′), специфічних для праймерів Smarcb1 (5′-TAGGCACTGGACATAAGGGC-3 ′ і 5′-GGAC-GTC-GAC-GTC-GTA-GGAC-3 ′ GAC-GTC-GAC-GAC-GTC-GTA та специфічні для праймерів Smarca4 (5′-GCCTTGTCTCAAACTGATAAG-3 ′ та 5′-GTCATACTTATGTCATAGCC-3 ′ та 5′-GATCAGCTCATGCCCTAAGG-3 ′). Мишей інтенсивно контролювали двічі на день, включаючи контроль ваги та розміру.
Гістологія/імунофарбування.
Вкладену в парафін тканину секціонували, депарафінізували та регідратували перед тим, як індукований теплом пошук антигену проводили при 100 ° C протягом 20 хв у 10 м м натрій-цитратному буфері для всіх антитіл. Імуногістохімічне фарбування проводили з використанням первинних антитіл (NeuN, Smarcb1, Calbindin, Cre, фосфо-Гістон H3) та системи фарбування HRP/DAB (DAKO) відповідно до технічних вимог виробника. Гемалоун використовувався для ядерного фарбування. Для імунофлуоресцентних подвійних фарбувань зрізи двічі промивали PBS/0,1% Triton X-100 і потім інкубували в блокувальному буфері (блокуючий реагент на основі білка I-Block; Applied Biosystems) протягом 30 хв. Первинні антитіла розводили в блокувальному буфері і застосовували протягом ночі при 4 ° С. Далі тканину двічі промивали PBS/0,1% Triton X-100 і інкубували ще 60 хв з розведенням мічених флуоресценцією вторинних антитіл (козяча анти-миша Alexa546; козяча проти кролика Alexa488, Invitrogen) для блокування буфер. Зрізи двічі промивали PBS/0,1% Triton X-100, фарбували 4 ', 6-діамідино-2-феніліндолом (DAPI) і встановлювали у флуоресцентному монтажному середовищі (DAKO). Всі зображення зрізів тканин були зібрані на мікроскопі Olympus IX50 у поєднанні з системою кольорового зображення Soft Imaging System.
Культура клітин.
Культури попередників нейронів мозочкових гранул були створені, як описано раніше (Lorenz et al., 2011). Коротко кажучи, мозочок післяпологових цуценят 5-го дня (P5) виймали і готували в HBSS (Invitrogen) з додаванням глюкози. Оболонки мозку та тканини сплетення були обережно видалені. Дисоціація об’єднаного мозочка була спричинена трипсином-ЕДТА-ДНКазою. HBSS замінили культуральним середовищем, що містить DMEM-F12 (Invitrogen), 25 м м KCl, добавку N2 (Invitrogen), пеніцилін-стрептоміцин (Pen-strep) та 10% фетальної телячої сироватки (FCS) (Sigma). Після центрифугування клітини висівали при концентрації 3 млн./Мл у лунки, покриті полі-1-орнітином (Sigma), та інкубували при 37 ° С протягом 6–12 год для відновлення. Потім середовище замінили на безсироваткове культуральне середовище, що містить Shh-білок (R&D Systems) у концентрації 3 мкг/мл.
Виробництво вірусів IRES-GFP та Cre-IRES-GFP проводилось, як було опубліковано раніше (Lorenz et al., 2011). Коротко, 293 пакувальні клітини (Invitrogen) вирощували в DMEM-10% FCS-Pen-strep-300 мкг/мл G418 і трансфікували по 10 мкг кожної вірусної конструкції, а також vsv-g та gag-pol плазміди, використовуючи Реагент для трансфекції Fugene 6 (Roche). Вірус, що містить середовище (без G418), збирали кожні 24 год протягом 3 днів поспіль, об’єднували, фільтрували та зберігали при -80 ° C до використання.
Для експериментів, показаних на малюнку 2, клітини сортували FACS на основі експресії GFP, використовуючи FACS ARIA III (BD Bioscience). Після сортування FACS клітини замінювали з щільністю 3 млн./Мл у лунки, покриті полі-1-орнітином (Sigma), та інкубували при 37 ° C протягом 6–12 год для відновлення. Ці клітини нарешті використовувались для експериментів з підрахунку клітин [з використанням камери Нойбауера та автоматизованого лічильника клітин TC10 (Bio-Rad)] та для аналізу РНК.