Загальна трансплантація калової мікробіоти полегшує стеатогепатит, спричинений дієтою, у мишей через
Предмети
Анотація
Вступ
Примітно, що упередженість печінково-інфільтруючих Т-клітин разом із виділеними цитокінами відіграє ключову роль у запаленні та прогресуванні NASH 7. Тим часом мікробіота кишечника відіграє важливу роль у підтримці гомеостазу адаптаційної імунної системи та регулює функції Т-клітин, що частково може бути пов’язано з такими метаболітами, як коротколанцюгові жирні кислоти (СКЖК) 8,9,10. Таким чином, ми провели це дослідження та висунули гіпотезу, що FMT покращує екосистеми мікробіоти шлунково-кишкового тракту, регулює метаболіти кишечника, такі як коротколанцюгові жирні кислоти, та виправляє дисбаланс імунної системи печінки, що призводить до послаблення дієти з високим вмістом жиру (HFD). стеатогепатит у мишей.
Матеріали і методи
Експерименти на тваринах
Самці мишей C57BL/6 без специфічних патогенів (SPF) (SLAC Laboratory animal co., LTD, Шанхай, Китай) розміщувались у високоефективних клітинах з фільтруванням повітря, що містять тверді частинки, зі стерилізованими підстилками та годували автоклавною чау і водою ad libitum. Усі експерименти на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин лікарні Сіньхуа, яка є афілійованою особою при Шанхайській медичній школі університету Цзяо Тун, і всі експерименти проводились відповідно до Керівництва Національної дослідницької ради з догляду та використання лабораторних тварин.
Мишей випадковим чином розподіляли на три групи (по 12 мишей на групу). Контрольну групу годували стандартним чау протягом 16 тижнів. Групу з HFD годували HFD (88% стандартна дієта, 10% сало та 2% холестерину) протягом 16 тижнів. Групу з HFD + FMT годували HFD протягом 16 тижнів та лікували FMT протягом останніх 8 тижнів. Всім мишам давали комбінацію пеніциліну (2000 Од/мл) та стрептоміцину (2 мг/мл) (Sigma Aldrich, США) у питній воді протягом 3 днів для видалення корінних мікроорганізмів кишечника. Після такої обробки з контрольної групи відразу після дефекації збирали 200 мг свіжого стільця, який ресуспендували у 5 мл фізіологічного розчину, перемішували на вортексі протягом 3 хв і давали відстоятися самопливом протягом 2 хв, і свіжий стілець збирали щодня . Трансплантацію мишам-реципієнтам досягали шляхом промивання 200 мкл супернатанту із зразка калу один раз на день протягом 8 тижнів 11 .
Кожну мишу зважували раз на тиждень і розраховували щотижневе споживання їжі на мишу для різних груп. Мишей приносили в жертву через 16 тижнів і збирали кров від серця натще. Тканини печінки, тонкої кишки, вміст сліпої кишки та епідидимальної жирової тканини кожної миші або фіксували в 4% розчині параформальдегіду, заморожували в гелі оптимальної температури різання, або заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 ° C.
Мікробний аналіз калу
Аналізи сироватки
Аланінамінотрансферазу натще (ALT), аспартатамінотрансферазу (AST) та глюкозу в крові (FBG) вимірювали за допомогою автоматизованого аналізатора (Sysmex CHEMIX-180, Японія). Сироватковий інсулін (набір ELISA для інсуліну для щурів/мишей, Merck-Millipore) вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу, концентрацію ендотоксину миші в сироватці вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (Mouse ET ELISA Kit, Trust Specialty Zeal) та зразки і стандарти оброблялись відповідно до інструкцій виробника. Оцінку моделі гомеостазу на інсулінорезистентність (HOMA-IR) розраховували за рівнянням: FBG (ммоль/л) × інсулін (мО/л)/22,5. Індекс чутливості до інсуліну (ISI) розраховували за рівнянням: 1/(FPG (ммоль/л) × інсулін (мО/л)).
Вимірювання тригліцеридів та холестерину в печінці
Внутрішньопечінкові тригліцериди (TG) та холестерин вимірювали за допомогою набору для аналізу тригліцеридів або набору для аналізу холестерину (Applygen Technologies Inc., Пекін, Китай). Потім зразки та стандарти обробляли відповідно до інструкцій виробника. Кінцеві концентрації тригліцеридів та холестерину коригували на вміст білка.
Гістологічний аналіз
Парафінові альдегідні парафінові зрізи печінки та тонкої кишки фарбували гематоксилін-еозином для патологічного аналізу або трихромним плямою Массона від фіброзу. Оцінювали показник безалкогольної жирної активності печінки (NAS) і заморожені зрізи печінки фарбували олійно-червоним O. Для іммугогістохімічного фарбування використовували зрізи, вбудовані у парафін. Застосовували кон'юговане з пероксидазою хрону вторинне антитіло і реакцію візуалізували за допомогою 3,3'-діамінобензидину тетрагідрохлориду. Скла були забарвлені гематоксиліном. Позитивні області кількісно визначали за допомогою зображення J2x. Анти-Foxp3 та анти-ZO-1 антитіла були придбані у Abcam (MA, США), а IFN-γ, IL-4, IL-17 та IL-22 - у Bioworld (MN, США).
Кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (qPCR)
Загальну РНК екстрагували з печінки, тонкої кишки або епідидимального жиру за допомогою Trizol (D9108B, Takara, Далянь, Китай) і реверсивно транскрибували в кДНК, використовуючи Primescript RT Master Mix (RR036A, Takara, Dalian, Китай). QPCR у реальному часі проводили на ПЛР-системі реального часу Applied Biosystems 7500 із використанням SYBR Premix Ex Taq (Tli RnaseH Plus) (RR420A, Takara, Далянь, Китай). Праймери для цільових генів були синтезовані компанією Sangon Biotech (Шанхай, Китай). Послідовності праймерів для генів наведені в додатковій таблиці 1. Специфічність праймера підтверджена кривою дисоціації за допомогою програмного забезпечення SDS 7500 системи. Як внутрішній контроль використовували гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH).
Вестерн-блот-аналіз
Печінку лізували в крижаному буферному аналізі радіоімунопреципітаційного аналізу (RIPA), що містив інгібітори протеази та фосфатази (фенілметилсульфонілфторид, PMSF) (Beyotime, Шанхай, Китай). Загальний білок вимірювали методом білкового аналізу біцинонінової кислоти (BCA, Beyotime, Шанхай, Китай). Виявлено Foxp3, IFN-γ, IL-4, IL-17, IL-22 та рецептори інсуліну (IR, Abcam) у печінці, а актин використовували як контроль навантаження. Імунні комплекси виявляли за допомогою іммоболонного західного хемілюмінесцентного субстрату HRP (Millipore Corporation, Billerica, MA). Діапазони були кількісно визначені Image Lab версії 2.0.1 (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія).
Кількісна оцінка вмісту сліпої кишки в коротколанцюгових жирних кислотах
Для визначення рівня SCFA проводили аналітичну рідинну хроматографію високого тиску (ВЕРХ, Agilent 1200, Wilmington, DE, США). Коротше кажучи, стандартні розчини ацетату, пропіонату та бутирату (усі фірми Sigma-Aldrich) готували при різних концентраціях (3-6000 нг/мл). Ці розчини аналізували за допомогою ВЕРХ, а вміст сліпої кишки розчиняли в 0,1% мурашиної кислоти та аналізували аналогічним чином для вимірювання загальної концентрації всіх трьох вільних жирних кислот 11 .