Залежне від гліфосату інгібування фотосинтезу у Верби

Марсело П. Гомес

1 Лабораторія екотоксикології водних мікроорганізмів, GRIL, TOXEN, Відділ біологічних наук, Університет Квебеку в Монреалі, Монреаль, QC, Канада

2 Laboratório de Fisiologia Vegetal, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Minas Gerais, Белу-Орізонті, Бразилія

Сара Г. Ле Манах

Луїза Ено-Етьє

3 Інститут наук про навколишнє середовище, Університет Квебека в Монреалі, Монреаль, КК, Канада

Мішель Лабрек

4 Institut de Recherche en Biologie Végétale, Монреальський ботанічний сад, Монреаль, QC, Канада

Марк Люкотт

3 Інститут наук про навколишнє середовище, Університет Квебека в Монреалі, Монреаль, КК, Канада

Філіпп Джуно

3 Інститут наук про навколишнє середовище, Університет Квебека в Монреалі, Монреаль, КК, Канада

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Гліфосат [N- (фосфонометил) гліцин)] є найбільш широко застосовуваним гербіцидом у всьому світі з моменту впровадження рослин, стійких до гліфосату (GR) (Coupe et al., 2012). Хоча він був запропонований як один з найменш токсичних пестицидів для тварин та людей (Williams et al., 2000; Cerdeira and Duke, 2006), широке використання гліфосату разом з його великою розчинністю викликає певні занепокоєння щодо його можливого впливу на навколишнє середовище.

Реактивні форми кисню є важливими для сигналізації рослин; однак, накопичившись, АФК стають токсичними, індукуючи незворотні зміни в метаболізмі, клітинному циклі та посилюючи окислювальні сплески (Gomes et al., 2014a). Взаємодіючи з біологічними молекулами, АФК може спричинити руйнування ДНК, ліпідів та білків (Foyer and Noctor, 2011). Щоб уникнути окисного пошкодження внаслідок накопичення АФК, рослини розробили ферментативну (наприклад, SOD, CAT, APX, GPX та GR) та неферментативну (наприклад, аскорбат та глутатіон) системи (Foyer and Noctor, 2011). Активність антиоксидантних систем, а також ступінь перекисного окислення ліпідів є маркерами окисного стресу, які, як було показано, модулюються впливом гліфосату (Ahsan et al., 2008; Moldes et al., 2008; Miteva et al., 2010).

Матеріали і методи

Тепличні експерименти

Фотосинтез (з використанням кінетичних вимірювань флуоресценції хлорофілу) та біохімічні оцінки проводили через 0, 6, 24, 48 та 72 год після початку обробок. Оцінки були припинені через 72 години впливу, оскільки рослини, які отримували найвищий рівень гліфосату, виявляли виражені симптоми інтоксикації, включаючи кілька некротичних плям та втрату листя (дані не наведені). Після оцінки провідності фотосинтезу та устьиць рослини збирали та ретельно промивали дистильованою водою. Зразки від сьомого (першого повністю розширеного листка від верхівки) до дев'ятого листка негайно заморожували в рідкому азоті і зберігали в папері з алюмінієвої фольги при -80 ° C до біохімічних оцінок та оцінок окисних пошкоджень.

Газообмін, флуоресценція хлорофілу та концентрації пігменту

Газообмін, флуоресценцію хлорофілу та вміст пігменту вимірювали на зразках з першого, другого та третього повністю розширених листків (сьоме – дев’яте листя з верхівки), які також отримували гербіцид, в цілому три вимірювання на рослину. Вимірювання провідності устьиць (gs) проводили за допомогою листового порометра (модель SC-1, Decadon Devices Inc., Вашингтон, округ Колумбія, США). Потім ці листки піддавали темній клітці протягом 20 хв, і випромінювання флуоресценції хлорофілу оцінювали за допомогою флуорометра з імпульсно-амплітудною модуляцією (PAM) (модель PAM-2500, WALZ, Effeltrich, Німеччина). Аналіз RLC проводили згідно з Джуно та співавт. (2015). Було проведено 11 кроків RLC. Насичувальні імпульси спрацьовували з інтервалами 0,8 хв з різною актинічною інтенсивністю світла для кожного кроку (0, 31, 48, 76, 117, 179, 253, 405, 586, 874 та 1326 мкмоль фотонів м -2 с -1). За допомогою RLC проводили оцінку таких параметрів: ETR (Krall and Edwards, 1992), qP (van Kooten and Snel, 1990), UQFrel (Juneau et al., 2005), NPQ (Redondo- Gómez et al., 2008) та FV/FM (Kitajima and Butler, 1975). Для порівняння методів лікування використовували результати флуоресценції фотонів 874 мкмоль м -2 с -1 (найбільш подібне опромінення щодо умов росту світла). Також були побудовані криві ETR проти опромінення, а ETRmax та Ik були розраховані згідно з Eilers and Peeters (1988).

Для оцінки пігментів з кожного листа брали по три позакореневі диски діаметром приблизно 5 мм, а після визначення свіжої маси зразків їх хлорофіл та каротиноїдні пігменти витягували у 80% ацетоні після мацерації дисків ступкою. Спектральне поглинання екстрактів (від 300 до 800 нм) вимірювали за допомогою спектрофотометра Varian Cary ® 300 Bio UV-Vis (Varian, США). Концентрації (мкг/г маси свіжого листя) загальних хлорофілів та каротиноїдів розраховували, використовуючи рівняння, описані Ліхтенталером та Веллберном (1983).

Біохімічні оцінки

Для оцінки окисних реакцій вивчали вміст H2O2, MDA та активність антиоксидантних систем, дотримуючись методів, описаних Gomes et al. (2014c). H2O2 екстрагували в 2 мл 0,1% трихлороцтової кислоти (ТСА) і після центрифугування при 12000 × g протягом 15 хв 300 мкл центрифугованої надосадової рідини реагували з 0,5 мл 10 мМ фосфатного буфера калію (pH 7,0) і 1 мл 1 М КІ. Зразки відчитували при 390 нм, і концентрації H2O2 визначали, використовуючи коефіцієнт екстинкції (𝜀) 0,28 мМ -1 см -1. Оцінка перекисного окислення ліпідів базувалася на утворенні 2-тіобарбітурової кислоти реактивних метаболітів, особливо MDA. Зразки, що містять 200 мг листкової та кореневої тканини, мацерували в 5 мл 0,1% ТСА. Після повної гомогенізації 1,4 мл гомогенату переносили в пробірку Епендорфа і центрифугували при 10000 об/хв протягом 5 хв. Аліквоту 0,5 мл супернатанту додавали до 2 мл 0,5% (об/об) TBA (тіобарбітурової кислоти) у 20% TCA. Суміш нагрівали на водяній бані при 95 ° С протягом 30 хв, а потім охолоджували льодом протягом 10 хв. Показання проводили за допомогою спектрофотометра при 535 і 600 нм.