Жирова надмірна експресія фосфоенолпіруват-карбоксикінази призводить до високої сприйнятливості до

Анотація

НЕТ, коричнева жирова тканина
FFA, вільна жирна кислота
PEPCK, фосфоенолпіруват-карбоксикіназа
PGC, PPAR-γ-коактиватор
PPAR, рецептор, активований проліфератором пероксисоми
TZD, тіазолідиндіон
UCP, роз’єднує білок
ВАТ, біла жирова тканина

Ожиріння є основною проблемою охорони здоров'я західних суспільств. Ця зміна метаболічної та ендокринної функцій жирової тканини часто пов’язана з інсулінорезистентністю та діабетом 2 типу. Незрозуміло, як збільшена маса жирової тканини призводить до резистентності до інсуліну печінки та м’язів та до гіперсекреції інсуліну підшлункової залози. Жирова тканина виділяє кілька білків, що називаються адипоцитокінами, які можуть впливати на метаболізм глюкози та чутливість до інсуліну та пов’язувати підвищене ожиріння та резистентність до інсуліну (1,2). Однак надлишок вільних жирних кислот (FFA), що виділяються жировою тканиною при ожирінні, також може бути відповідальним за розвиток інсулінорезистентності (3–7). Збільшення рівня FFA у плазмі зменшує екстракцію інсуліну печінкою та посилює печінковий глюконеогенез (4,7). У м’язах підвищена швидкість окислення жиру погіршує опосередковану інсуліном утилізацію глюкози, гальмуючи окислення глюкози та синтез глікогену (3). Більше того, інсулінорезистентність відповідає стимуляції проліферації β-клітин та секреції інсуліну (6).

Жирні кислоти, що виділяються в кров, виникають внаслідок різниці між гідролізом тригліцеридів в адипоцитах під час ліполізу та повторним використанням жирових клітин FFA через марний цикл, який називають реестерифікацією (8,9). Жирова тканина буферизує ліпідні потоки, пригнічуючи вивільнення FFA і збільшуючи кліренс тригліцеридів (10). Однак при ожирінні порушення цієї буферної дії може сприяти накопиченню тригліцеридів у печінці, скелетних м’язах та β-клітинах підшлункової залози, що, в свою чергу, може призвести до інсулінорезистентності (10).

Тіазолідиндіони (TZD), специфічні активатори активованого рецептором проліфератора пероксисоми (PPAR) -γ, покращують чутливість до інсуліну у хворих на цукровий діабет 2 типу (11). TZD мають прямий протидіабетичний ефект на метаболізм глюкози в скелетних м'язах та печінці (12). Крім того, TZD підвищують чутливість до інсуліну, збільшуючи здатність жирової тканини зберігати ліпіди та зменшуючи рівень циркулюючої жирної кислоти та тригліцеридів (13). TZD зменшують вивільнення жирової кислоти з жирової тканини за рахунок збільшення реестерифікації FFA за рахунок індукції як фосфоенолпіруват-карбоксикінази (PEPCK), регуляторного ферменту гліцеронегенезу, так і гліцерол-кінази (14,15).

Збільшення рівня гліцеронеогенезу у трансгенних мишей, які надмірно експресують PEPCK в жировій тканині, призводить до збільшення реестерифікації FFA; більший розмір адипоцитів, жирова маса та маса тіла; та зменшення циркулюючих FFA (16). Більше того, незважаючи на ожиріння, толерантність до глюкози та чутливість до інсуліну всього тіла зберігаються (16). Це говорить про те, що ожиріння без збільшення циркулюючих FFAs не призводить до інсулінорезистентності або діабету 2 типу. Таким чином, ми дослідили цих трансгенних мишей, щоб визначити, чи протидіє підвищена реестерифікація FFA інсулінорезистентності, викликаній дієтою з високим вмістом жиру. Після 6 тижнів на цій дієті трансгенні миші набрали більше маси тіла і виявили більш виражену непереносимість глюкози та резистентність до інсуліну, ніж контрольні миші. Таким чином, як це не парадоксально, але надмірна експресія PEPCK спричиняє чутливість до інсуліну при звичайній дієті, але резистентність до інсуліну при дієті з високим вмістом жиру.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Лікування мишей.

РНК-аналіз.

Загальну РНК отримували з WAT та BAT за допомогою ізолюючого реагенту Qiazol (Qiagen, Hilden, Німеччина). РНК розділяли електрофорезом на 1% агарозному гелі, що містить 2,2 моль/л формальдегіду. Вестерн-блот гібридизували з 32 зміченими Р-метками PEPCK, PGC-1α, PPAR-γ, 18S рРНК та зДНК-зондами UCP-1 (17–20).

Виявлення білка вестерн-блот.

Вестерн-блот-аналіз проводили за стандартними процедурами із загальних клітинних гомогенатів WAT та BAT (21). Тканини гомогенізували в буфері, що містить 20 ммоль/л HEPES, рН 7,9, 25% (об./Об.) Гліцерину, 420 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л KCl, 0,5 ммоль/л дитиотреитолу, 1,5 ммоль/л MgCl2, 0,2 ммоль./л ЕДТА, 0,5 ммоль/л фенілметилсульфонілфториду, 20 мкмоль/л лейпептину, 20 мкмоль/л пепстатину, 20 мкмоль/л апротиніну, 50 ммоль/л NaF та 2 ммоль/л ванадата Na. Зразки центрифугували (15000 г), а аліквоту надосадової рідини аналізували на концентрацію білка за методом Бредфорда, як описано виробником (аналіз білка Bio-Rad; Bio-Rad, Hercules, CA). Двадцять п’ять мікрограмів білка аналізували за допомогою 10% SDS-PAGE і переносили в нітроцелюлозні мембрани. Білки виявляли за допомогою антитіл кроличих поліклональних анти-PPAR-γ-коактиваторів (PGC) -1 (Chemicon International, Темекула, Каліфорнія), розведених 1: 2000, антитіл кроличих поліклональних антизчеплюючих (UCP) -1 (Abcam, Cambridge, UK) антитіл розведений 1: 1000, а кроляча поліклональна антипіруват-карбоксикіназа (PCK) -1 (Abgent, Сан-Дієго, Каліфорнія) розведена 1: 500.

Аналізи ферментів, метаболітів та гормонів.

Вміст тригліцеридів у тканинах визначали шляхом виділення загальних ліпідів із зразків печінки та НДТ хлороформом-метанолом (2: 1 об./Об.), Як описано раніше (22), розділяючи фази хлороформу та метанолу-води. Потім тригліцериди кількісно визначали спектрофотометрично, використовуючи набір ферментативних аналізів (GPO-PAP; Roche Diagnostics, Базель, Швейцарія). Глюкозу вимірювали ферментативно (Glucoquant; Roche Diagnostics) у сироватці крові. Глюкозу також визначали у 5 мкл крові за допомогою аналізатора Glucometer Elite (Bayer, Леверкузен, Німеччина). Тригліцериди сироватки крові визначали ферментативно (GPO-PAP). FFA вимірювали в сироватці крові методами ацил-КоА-синтази та ацил-КоА-оксидази (Wako Chemicals, Neuss, Німеччина). Рівні інсуліну в сироватці крові вимірювали за допомогою радіоімунологічного аналізу (CIS Biointernational, Gif-Sur-Yvette, Франція). Концентрацію лептину визначали в 5 мкл сироватки крові за допомогою набору для аналізу імуноабсорбуючих речовин (Crystal Chemical, Чикаго, Іллінойс), дотримуючись інструкцій виробника. Рівні адипонектину в сироватці крові вимірювали радіоімуноаналізом (Linco, St. Charles, MO).

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну.

Для тестів на толерантність до глюкози контрольним мишам і трансгенним мишам голодували протягом ночі (16 год) із вільним доступом до води і вводили внутрішньочеревно ін'єкцію глюкози (1 г/кг маси тіла). Зразки крові отримували з хвостової вени перед ін'єкцією глюкози та у зазначені моменти часу після навантаження глюкозою та вимірювали концентрацію глюкози. Для тестів на толерантність до інсуліну інсулін (0,75 МО/кг маси тіла; Humulin Regular; Eli Lilly, Indianapolis, IN) вводили внутрішньочеревно контрольним і трансгенним мишам. Концентрацію глюкози визначали у зразках крові, отриманих із хвостової вени у зазначені моменти часу після ін’єкції інсуліну.