Амфетамін маніпулює рівнем і поведінкою моноаміноксидази-А, використовуючи тераностичні аптамери
Анотація
Передумови
Ферменти моноаміноксидази (МАО) відіграють важливу роль у контролі катаболізму моноамінових нейромедіаторів та біогенних мікроамінів та поведінки у людей. Однак механізми, що регулюють МАО, незрозумілі. Кілька білків фактора транскрипції пропонуються для модуляції транскрипції МАО ген, але дані, що підтверджують ці гіпотези, суперечливі. Ми мали на меті дослідити механізм білків-регуляторів транскрипції генів на індуковану амфетаміном поведінку. Ми застосували аптамери, що містять послідовність зв'язування ДНК, а також випадкову послідовність (без мішені) для вивчення модуляції індукованих амфетаміном рівнів МАО та гіперактивності у живих мишей.
Методи
Ми попередньо обробляли дорослих самців мишей C57black6 (Taconic Farm, Germantown, NY) (n ≥ 3 послідів за раз), віком від 2 до 3 місяців (вага тіла 23 ± 2 г) з дволанцюжковими (ds) аптамерами ДНК з послідовністю специфічно для активатора білка-1 (5ECdsAP1), ядерного фактора-каппа-бета (5ECdsNF-kB), спеціального білка-1 (5ECdsSP-1) або циклічногоAMP, що реагує на зв'язування білка (5ECdsCreB), ділянок зв'язування з білками, 5ECdsRan [випадкова послідовність без мішені], одноланцюговий AP-1 (5ECssAP-1) (8 нмоль ДНК на кг) або фізіологічний розчин (5 мкл, внутрішньоцеребровентрикулярна [icv] ін’єкція) перед введенням амфетаміну (4 мг/кг, в/в). Потім ми вимірювали та аналізували рухову активність та рівень активності МАО-А та МАО-В.
Результати
У патологічному стані впливу амфетаміну ми показали тут, що попередня обробка 5ECdsAP1 та 5ECdsNF-kB скасувала зменшення активності МАО-А (стор
Передумови
МАО каталізує окисне дезамінування ендогенних моноамінів в організмі людини [8]. Існують дві ізоформи МАО (МАО-А та МАО-В), локалізовані у зовнішній мітохондріальній мембрані; вони розподіляються по всій нервовій системі, а також в інших регіонах тіла, включаючи травну та кровоносну системи. Дефіцит МАО-А в результаті мутації в МАО-А ген може спричиняти характерний набір симптомів (тобто, легку розумову відсталість, імпульсивну асоціальну поведінку та розлади настрою та паніки), які разом називають синдромом Бруннера [9]. Мутації в миші МАО ген надає той самий фенотип [10]; отже, миша - ідеальна тваринна модель для доклінічних експериментів, що включають маніпуляції МАО-А.
Цікаво, що підвищені білки фактора транскрипції AP-1 та NF-kB та мікрогліальна активація також є відомими асоціаціями при ішемічно-реперфузійній травмі, моделі розладу Паркінсона та вірусної інфекції імунодефіциту людини. Варіація в МАО-А експресія була пов'язана з поліморфізмом в промоторній області [11, 12], яка також показала, що містить щонайменше одну консенсусну послідовність для зв'язування AP-1 та SP-1 [13-16]. Щоб краще зрозуміти, як ці два білки TF можуть впливати на активність МАО-А, ми застосували альтернативний підхід, використовуючи дволанцюжковий (ds) аптамер ДНК з консенсусною послідовністю для цих білків TF. Ми продемонстрували специфічне та чутливе зв'язування аптамерів dsAP1 та dsNF-kB з білками AP-1 та NF-kB відповідно [5], включаючи нульове зв'язування з аптамером AP-1 у мишей з мутантними білками AP-1 [ 17]. МАО-А міститься в цитоплазмі дофамінергічних нейронів в SN, pars compacta, гіпоталамусі та VTA середнього мозку. Оскільки мезолімбічні нейрони шляху винагороди мають аксональні проекції, що походять від VTA, ми дослідили антиген МАО-А в області VTA. Тут ми співвідносимо вплив аптамерів dsAP-1/NF-kB на рухову активність з експресією МАО-А у ВТА живих мишей, що зазнали дії амфетаміну.
Методи
Тварини та житло
Усі процедури, використані у цьому дослідженні, були затверджені Підкомітетом з досліджень догляду за тваринами в штаті Массачусетс, інституційним комітетом з питань захисту тварин, відповідно до Керівництва державної служби охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин. Дорослих самців мишей C57black6 (Taconic Farm, Germantown, NY) (n ≥ 3 послідів за раз), віком від 2 до 3 місяців (23 ± 2 gm BW), утримувались у клітках на підстилці з тирси, в кімнаті з контрольованим світлом цикли (12 год світло/12 год темно), де вони мали вільний доступ до води та харчувались стандартною лабораторною чау. Мишей навчали, оперували та тестували рандомізованим способом, при цьому сліпий спостерігач виконував поведінкове тестування.
Коротка dsDNA для білка, що зв'язує AP1
Двоцепочечна ДНК, що містить консенсусну послідовність (позначається великими літерами) для білка AP1 (5'-флуорецеїн ізотіоціанат [FITC] -tccggcTGACTCAtcaagcg-3 'та 3'-aggccgACTGAGTagttcgc-біотин-5') були модифіковані шляхом фосфоротіонізації яка сірка замінює немостовий кисень на фосфатних зв’язках трьох, чотирьох або п’яти нуклеотидів (малі літери) з обох кінців (кінцеві кришки, ЕС). Додаткові 5ECdsDNA для факторів транскрипції включають SP1 (5ECdsSP-1, 5’-ctcgcCCCGCCccgatcgaa-біотин та 3’-gagcgGGGCGGggctagctt); ядерний фактор каппа бета (5ECdsNF-κβ, 5’-agttgaGGGGACTTTCCcaggc-біотин та 3 ’tcaactCCCCTGAAAGGgtccg) та білок, що зв’язує елемент циклічної відповіді AMP (5ECdsCREB, 5’-ctctcTGACGTCAggcaat-біотин та 3’-гагагACTGCTGTccgtta). Коли в якості контролю використовували одноланцюгову ДНК, олігоДНК повністю модифікували шляхом фосфоротіонування.
Обидві нитки послідовностей, що зв'язують фактор транскрипції, змішували при кімнатній температурі, нагрівали при 65 ° C протягом п'яти хвилин і повільно охолоджували на термоциклері (падіння на 1 градус в хвилину) до 20 ° C, при якій температуру вони підтримували протягом 30 хв. . Короткі дсДНК зберігали в аликвотах по 0,05 мл (100 мкМ) при -20 ° C. За годину до використання одну аликвоту розморожували до кімнатної температури.
Доставка аптамерів 5ECdsDNA
Для досліджень поглинання ми знеболили мишей чистим O2 плюс 2% галотану зі швидкістю потоку 800 мл/хв і доставили аптамери dsDNA (8 нмоль ДНК на кг, = По 4) шляхом ін’єкції icv [18, 19], прийнятий шлях доставки для введення контрастних речовин гризунам та приматам нелюдей [20–22]. Ми доставили 8 нмоль ДНК на кг (icv) для досліджень нокдауну білка TF [23]. Через три години після доставки ДНК ми вводили або фізіологічний розчин (0,1 мл, в/в), або амфетамін (4 мг на кг, в/в). Поглинання різних аптамерів 5EDdsDNA проводили та перевіряли, як описано раніше; всі фотографії були отримані з однаковим часом експозиції за допомогою CCD-камери Himatsu на мікроскопі Olympus (Optical Analysis Corp, NH) [5].
Тестування поведінки після амфетаміну
Всім мишам проводили попереднє кондиціонування щонайменше 48 год у випробовувальній клітці, яка була обладнана детектором руху [21]. Ми доставили dsDNA або контрольний (icv) за три години до введення амфетаміну [23]. Після доставки амфетаміну мишей негайно поміщали в домашні клітини, де ми вимірювали їх рух протягом 60 хв.
Поводження з тваринами
Для того, щоб мінімізувати ефект стресу, який тварини можуть відчувати, перебуваючи в різних середовищах до та під час стимуляції амфетаміном, кожна миша була розміщена в одній клітці протягом усіх експериментів, що включало тиждень звикання до нового середовища. За три дні до попередньої обробки амфетаміном ми звикли всіх тварин шляхом щоденного введення сольового розчину (0,25 мл) та оцінки поведінки як вихідного рівня кожного дня. Кожну домашню клітку розміщували безпосередньо в системі автоматичного запису, перш ніж тваринам вводили амфетамін. Ми розділили тварин на дві групи, щоб отримати або амфетамін, або сольовий розчин (транспортний засіб) на наступні дні. Мишей ніколи не садили в нову клітку для оцінки поведінки, як описано [21].