Білковий інгібітор підшлункової ліпази з насіння Litchi chinensis

Света В. Мхатре

1 Департамент медичних біотехнологій, Школа біомедичних наук MGM, Інститут наук про здоров'я MGM, Сектор 1, Камоте 410209, Наві Мумбаї, Махараштра, Індія

2 Дослідницький центр MGMIHS OMICS, Центральна науково-дослідна лабораторія MGM, Медичний коледж і лікарня MGM, Інститут наук про здоров'я MGM, Сектор 1, Камоте 410209, Наві Мумбаї, Махараштра, Індія

Аміта А. Бхагіт

Раман П. Ядав

РЕЗЮМЕ

ВСТУП

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Виділення білка з насіння Litchi chinensis

Визначення концентрації білка

Для оцінки концентрації білка, виділеного з насіння Litchi chinensis, був проведений модифікований протокол для мікропроби Бредфорда (21). В аналізі 10 мкл білка додавали в 96-лункову мікропланшетну платівку (Tarsons Products Pvt. Ltd, Колката, Індія) і додавали 200 мкл 1 × реагенту Бредфорда (SERVA Electrophoresis GmbH, Гейдельберг, Німеччина). Платівку інкубували при кімнатній температурі (25 ° С) протягом 5 хв, а поглинання (А) вимірювали при 630 нм за допомогою зчитувача планшетів ELISA (модель Readwell TOUCH ™; Robonik, Ambernath, India). Стандартна крива бичачого сироваткового альбуміну (BSA; Sigma-Aldrich, Merck, Сент-Луїс, Міссурі, США) (1 мг/мл) була побудована з використанням значень поглинання, отриманих при різних розведеннях, коливаючись від 0 до 0,35 мг/мл. Загальну концентрацію білка, виділеного з насіння Litchi chinensis, розраховували за стандартною кривою BSA, використовуючи таке рівняння:

де A - поглинання при 630 нм, а γ - концентрація білка в мг/мл.

Аналіз активності ліпази з використанням синтетичного субстрату

Аналіз ліпази проводили методом, описаним Winkler і Stuckmann (22) з невеликими модифікаціями. Аналіз проводили у трьох примірниках із використанням 96-лункового мікропланшетного планшета (Tarsons Products Pvt. Ltd). Розчин ферменту ліпази підшлункової залози (5 мг/мл) із свинячої підшлункової залози (Sigma-Aldrich, Merck) готували в 0,1 М натрій-фосфатному буфері (pH = 8,0) і зберігали при 2-8 ° C до використання. Субстратом, що використовувався в цьому дослідженні, було 4,5 мг п-нітрофенілпальмітату (Sigma-Aldrich, Merck), розчиненого в 200 мкл N, N-диметилформаміду (SD Fine-Chem Ltd), і об'єм додавався до 10 мл, додаючи 0,1 М натрієвий фосфатний буфер (рН = 8,0). Реакційну суміш (10 мкл панкреатичної ліпази, 40 мкл 0,1 М фосфатного буфера натрію (рН = 8,0) і 150 мкл розчину п-нітрофенілпальмітату) інкубували при 37 ° С протягом 30 хв і вимірювали абсорбцію (А) при 405 нм при 0 і 30 хв. Одна одиниця ліпазної активності визначається як кількість вивільнення 1 нмоль/хв вільного фенолу із субстрату (п-нітрофенілпальмітату) в 0,1 М фосфатному буфері натрію (pH = 8,0) при 37 ° C.

Аналіз активності ліпази з використанням природного субстрату

Аналіз ліпази проводили за допомогою дещо модифікованого титриметричного методу (23) з оливковою олією (Research-Lab Fine Chem Industries, Мумбаї, Індія) та свинячою панкреатичною ліпазою (тип II). Розчин підшлункової залози свині (2 мг/мл) готували у 200 мМ трис-HCl (Sigma-Aldrich, Merck) буфер (pH = 7,7). Для визначення активності ліпази, автоклавовану дистильовану воду (2,5 мл), трис-HCl-буфер (1 мл), оливкову олію (3 мл) і фермент ліпази підшлункової залози (0,5 мл) ретельно перемішували та інкубували в інкубаторі з орбітальним струшувачем вентилятора. (Neolab Instruments, Мумбаї, Індія) у фіксованому положенні протягом 30 хв при 37 ° C. Реакцію зупиняли додаванням 3 мл 95% етанолу (Labindia, Navi Mumbai, India) з подальшим додаванням чотирьох крапель 0,9% індикатора тимолфталеїну (S D Fine-Chem Ltd), приготованого в 95%